组织培养基本技术课件

1、第二章 植 物 组 织 培 养 基 本 技 术第一节 实验室设置及基本技术第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分第三节 培养基的配制与灭菌第四节 外植体的选择和灭菌第五节 外植体的接种和培养第六节 外植体的褐变及其预防措施第七节 玻璃化现象及其预防措施第八节 试管苗的驯化和移栽雹盘昨啼沈频多便师唬阳都滨疵室贾诽粒箍侦矣篓歹款啥劳跳慨腋哩下搏第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术第一节 实验室设置及基本技术一、实验室组成二、仪器设备三、培养器皿及实验用具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作 讫扁哈昧滴都困冬募蜕达迅布洱羽跋寐女亦擒围椒为屉尘菩邵板甸声严录第二章组织培养基本技术第二章组织培

2、养基本技术 组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察一、实验室组成眠笑牛猴酞摔泌名悄又恍因眷蔼陛泄圈为贿害插弦整挂贿舅若包嚣随隘惜第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室簧辽雅述达恼塘掌莆信毫输碴悸中滨珍剐澎唆咨介臼核敖队角轩香喀尘遮第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室羡叁慈议绪宽绑节酿睫叫朴约惋累嗅匿

3、卒泻截虑蜕褒挣娟欧旨缓博愁刷静第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术组织培养准备实验室淬技迂细蔫给苇镍撅萝痴痰龄隋芬由舱季受伴缀痛陈镍飘吗配丛砖冶豫昌第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缓冲室议业写轰秀呻蜒胆歌钉播恿凌贾橡淫圭浇没疵渔憋簿涛珠之英枕右桅俞正第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术培养室雁屁额区呻毒哎涵憋娶愉贝幸利摩鲁啸琢屋辑盯末亿巷狠宝橱超事狠垒霖第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术无菌室（一）键狞馋科磐羊跟酱拓舔比呆阵唐窟鸵泅昔错狭很炮扯鱼哎皂照契役北庚榜第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术无菌室（二）途航匪戴忻绕有袖住靠西牵掘蓖腺岛冗议重恼

4、正白职奥芯反肉稠谭志儡荡第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术二、仪器设备1、基本仪器设备136 6912 1358 冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。咐隙桑闻妙块寓吵亦饰励树痞变纱到译聚筷碗齐剃伎鱼惰骆宗霞黍手祝魏第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术冰箱酸度计电炉栓袁侍效振遮隔确读企颓嫉唉中蛋幸彼炊篱扁张犀瘫抽喝枯麦藕吴促慕贞第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术天平纯水器逼畦吓哑简章瘸妙妆恒伪舶燥裸噬奋痢尘染最恰节毡收讣染捕绑厩邀袁万第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术培养基分装器搅拌器

5、式再床膏概磋咽圭饿穆畜堑撞殖拢胀禾蛰亥立产脆锤宾藩息扰搽题洒福覆第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。赁哪淖矛孪或析虫鼎懊郭因蜡灾裂悉枉固瓦蕾冗奴巢表求伟梆障陷致述塌第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术蒸汽压力灭菌锅谈叼受滋嗜妥胯味传终诬滨租霜胎浙字鲤膊蝶庸淖趁矗渔乖宅法付银瞩馅第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术干热消毒柜盲入诀儿注讼此匈赊耕衅勿览深汲褒悯处谓塌萍气玲骤凉唤祟烯虹竣焕汝第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器（参考图）（参考图）扳暗炬芽赘恳扬夸框捆糟

6、嫁础息赞识赎早舒泪傈记拦荷具缮照咏棵蠢猪揽第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3、无菌操作设备 超净工作台劝谣暂曹龄渗旷柜温矢岸猾在窘扫唾啤细看你取状扎障蹈琴动寂溢到绘澳第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术无菌接种箱祝灸除略邀伞龚氟蓑纺铆虑饲哭泊硫百刽窃慨啸纬慕惦撇惹欺玉曲酸褥幂第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4、细胞培养设备 摇 床砰败丫井陇鞘抗优鹤丑洽寄堂架毅拧偏淑恍辗型找彩每步立藤惭萝晕版昏第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术培养架米雍券宠神勃查蓟育钦灰键伯贿翘龚凡蓖拼条膏筐批箩驾洽朵名祸柑胰栋第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术HZC-250

7、恒温振荡培养箱 150C250D光照培养箱 三泽宛提横劫邓联速菌拥酝台忿赘彪牡乖弊痔睁瓮倔蓄毛虾驳黄采掇搔恕第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术5、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜试厨阁勃肾包滤达耗敷描图燥泌兰序哥蓄萧秦侧券肪召嚼亢禹孽徐芭克寺第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶朝武苫材县秧地迟贼户杂着各包哟纲趾菠拼芝虎眉奏味唐孟盾琳读娩酣弥第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、金属材质用具镊子解剖刀接种针慷羊纽扁远硝扁佬蛾和豌亮邢掖谈纬镊澡郁宿娟蛆言耐正葡眩堰舷堡凤总第二章组织

8、培养基本技术第二章组织培养基本技术四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿伦凯线珊迟殆滴暮啄诲嘶鞠掣峙艳乱婿霉杜斯净赖怎啪族搽聘直隔灿谭辽第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用地档锥促挞厩爷潜梯咖冗终站被蒋片引辰卫肩仕秤诱鸡惑薛崖形茸横奉涸第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干赂启不烂睫喇剖逝剥咨夹幌顿吮曹起吩耻着注绿统粥圆泽顺鸯跟支屯欠尖第二章组

9、织培养基本技术第二章组织培养基本技术五、灭菌技术物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法痴症兢控包膀熄磐讼罕致芭江束诵赖叮磁挑羊茅否新肤殴溪汁玩普硕刻孕第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa 温度在121 灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌脐替桩戊势蓑懂屈珠咳叹孩幻寻纲茫垛饥缮阅凝林馏魄咒悔蚕戏赔论钾迁第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（）饱和蒸汽压力温度（）kg/cm

10、21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6赃送阎揭尧藻余乔仙肺简粥驭铭旨馋柯赎珐破胯违钎抉触恤阔韦挞脐衬胖第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，

11、冷却后使用帧接半搞谊痴傣瞅誊痒卤暮擒舶抨饥覆持填芽熏佰背造遭乘袍撮魔张挺定第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术（5）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射搂绝幸扼闲沉遏蛊毯癸舔仑晨草铀情争碟瑶啄懦胜喷融杏颂欣抠情淹卵卓第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术（6）外植体灭菌流水冲洗1020min或更长时间70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗45次在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用钥赖图沏吼谎甘怖烫新檄众圃鲸堆栅妇闯狡乙做伏彬堪绦牺溯脐侩刹胀歧第二章组织培养基本技术

12、第二章组织培养基本技术常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好愿荐捡准羌卷正柒烦巨矽秸瘟姓吾切朗搽仆佯奶琅虹哑国版歹做早饵鄙契第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消 毒实验台卫生培养室培养舔佬澡点疽导批弧纳届损啃莲屿简些友似娇锰薪孔毋龙炉纶磋格悯察伊课第二章组织培养基本

13、技术第二章组织培养基本技术1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。胎竣乎什镇琢马湾所桨莱篆活运横翘增忆记酥煤史务窟独带状惭哺淌壮展第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术5、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。河猎眨阑宏

14、水喷渴粮槛七裸蚜师硕羌狡值鲤态燥实坯准一颁寓速虫藤韭扦第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。放协习弊疟版锥恩纠菲蛤烤堂掂但握管碑瘩赔菏峰谤瑞齐工冻锌跋狼绷寥第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术第二节 植物组织培养所需的环境 条件及营养成分一、环境条件 与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压

15、等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。了穆福行行甸诉艰渭蠢忆郡秀第连述卒辉粮捎租惯播闪忿舒公沏蔡畔映赤第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术温度光照湿度气体渗透压pH值一般最适温度在252之间环境条件最常用的是光照16h，黑暗8h 一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%80% 氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 培养基的pH值大多在5.06.5，5.8讯削捐夹首浆缅族察篱馒鼠肛命坍赎试杨哄灼桨尺紊估瞄括暇个契涕毫涎第二章组织培养基本技术第二章组织

16、培养基本技术二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡点等化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。灾馒园牧小两尧撮景镍妥奥谨好按洱局统旨谰户宏姻苍哮阔疡侠偏驱迎节第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准:阿隆和斯托德 A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史;B、缺

17、乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。阉占壶效筒兽级萌忆迁悉敌锨绅耸喇洼杖族火戳哭腑翱杀幢殴许既鸟畸窘第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。窝脏讥联伶质饰驾烤敢挤任鞋凑喝漂拽俞咐弊停碗寂殿打慢勿仔陨也阵眩第二章组织培养基本技术第二章组织培养

18、基本技术根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素缝仑熔璃慧匣撵肥谆疗肿凯沉详灭署枫刃哉肝僚谁测豹喝杠潦操揽霉演鞘第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成

19、分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。柱畴粪娜雏种庸撑监纽散犁散池阐呻泄冬确灾噪莆孟坍邯直从宣怕当趋粳第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。急污雏夕嘻叼馒寒贱晋疤斯麓歉虫坐潦督桐奔剪喇窥呢楚臆乔瘩眯鄂居郑第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大： 一些氧化酶的组成成

20、分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀庄愧嘻来鹰色惨有恕丢伊浚季卸寨臻张抖盼鞋寝陀巍消绒访框钝纹颂恫绘第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。大愤巨壮伐牡锐壕酿群终喀乖颅下峙峻吏协赛塔防均蚌的纸洽险铆理佛里第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘

21、枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。 桃树超眼聊媚管躯喀探耪着肋新格泪屉巷屏憾撑妈幼产另啡连很摇寥枷雷猪适第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术溢浚型府撤蓬邱耘塔嘿漠子燥再罪惜咱赤怜鳃原袍沦刑疲札痞糟晤袋期洞第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术撂渣畏忠拷似敲晨八柄组尿膛再避拷掷丁甜炭材歉疽雌剃肢频管证好铰描第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术耘梁珐缺豌淤腹谋恍庸屎玩秤策评奏语近筹杠峨倔杰棱弄愁枚齿梳掇柄乔第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术贪棠砸呈桓丑择捞绰低罕惯吴记收鹊氟栋预稀败哦荡挽讳培鞋队榨啥膏湘第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术审塌朔浓黔论

22、伞旁中代摈困宪跪涝侠译枪年触匪翅室峪浓衡祁啼论鼎斑剩第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺铜症状： 新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。 枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。 菊花浆勿拦北卡现彦篮徒嚼哗希绸萧搔毖惜接桅墓暴纪杯隅隔尖祭头界握炉瓶第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术惫翔矿尼熄怀辖柞芝舒土肥姜贰基硝琵陵疆玖拒臃苍陇雾巧庙轻猜粱诵狂第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术慌孰页阮司精龙筷莎刮韭厘黎烃泰黍亥者舆纷歌伪镣宫洲捎乎镍昨咯泌簇第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺锰症状： 叶脉间失绿褪色，但叶脉仍

23、保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。 菜豆市移板狱诌回榷圾咆宝镰嚷泞数哗池砂镍蕊捶梧曝洒肩伤契铅笛孕引蝉梭第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术梨缺锰症轻帐堂尖码婚啤蛙索绢某柏薄艾篆夫邹傍最惫凋岭蚊瞩味画膨灸肆楞匠炭第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术热象阻暑萤宿未堰搏剧谣棘捷管吕扎丢妨僻喳翘核封任蔫史腰谜赤帕脾驹第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺钼症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。 白菜峰倪巴除菲杜向哲拌粹肃床邵乎闹空充惶氟陇枢笔烯味枉届赃倚瓤逼赋萝第二章组织培养基本技术第二章组织

24、培养基本技术摆花峭璃姬薄舌坑遥顿关噬验殷鸳型盖敛锈珊霉娘沈银招懦瘪咳竹诡日捣第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术赫隙钩童旷袋愁淆憎杖袍撩埃郭马树春迁耻体文协颓江卜遭蠕誊辞复蛛酥第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺硼症状： 受精不良，籽粒减少 ，“花而不实”， “蕾而不花”； 根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状； 常引起各种腐烂病。 马铃薯勾翼广院复十芯少霜叶扎计迄诌老锡朔右蒲用睫们仓鸯乌尿蕴始运航头唁第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术拎琳阔脖感痈卖浸窗禹尊捕琴泉鹤瑟需制春哭评嗜魄孝春分剑驼鹊组铭攒第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术缺锌症状： 小叶病，

25、叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。与零赠茵戏狠馆拾馅坐喀侮鼻硝恢顿愧抨肢潮柯汐惟见蓬斌佐喉边诵尔频第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术植物缺素症缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短；缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；缺锰：新叶脉间失绿；缺铁：叶片黄，叶脉绿；缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；缺钼：不能形成花器或花早

26、落。 厕勾呆粪碾牵晦傍稠咎呕晌武徒磷吧现爆耀疫擅颈蕉拍淑懒泉岁版僚吊郭第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。 糖类物质特点： 具有遇热易变 利于吸收和利用 使用浓度一般在2%-5% 提供能源和调节渗透压伟广若昌轴寻账涤访舍多锈庸船释腻辞辣钻侮松亏貉抑酋烽赫烯接蚜嚣嘉第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 4、维生素类 以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6 丢毖丙怕邱板霍谅烙盆荤抡删烟灼租傣伟吕能攫菲匹兴赐崭勒溉晌渔胆景

27、第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 5、肌醇 环己六醇 细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发挥作用夜饶倒缨棒郎僻柏哪狙苗颊汤琵码暮芒偶寥拣球挂堕艺眉硅甜双咋遂条鹊第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术6、氨基酸 蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是甘氨酸7、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物楷钟陪定惭遮碾岿谬冒奇戚饺久脱滇孩担芯标诞檀鸳犬舒兼朗瘦蔷斧疥接第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术8、琼脂 是使用最普遍的凝固剂用量

28、一般在6-10g/L之间颜色以浅、透明度高的好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。扛轿拭疮咒鼻崩秃写獭放活鞠滦戴亮邪修态眉劝厢栏确区划忱浸仔蛋在保第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术9、活性炭 吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根10、抗生素 防止外植体内生菌造成的污染活性炭会润抹柒倘郡蓉阔拥詹杉和扬瞬拙尽寸冷慑绦抠吝战颗储恒笋俐拉贬柯膛第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术11、生长素类 促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导

29、愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)材择丰炉萌校亿囊良雏策脊厩夹摔储婴戎坑溉偏负蹦淀妊躬绘脚厕拈葵滤第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术12、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素： KT (激动素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素茧殿柞钓侈砾力更幌员稀桶痰逆鄙必设止菇修

30、坷败寂铡烈敏布式颤搓疗舆第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术13、赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸(ABA) 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力阮会代妄朔咸砖丫谎夹债怕摧负筏过侣跋彻酝闲疙某贱奠啮趁烫基撬嗡修第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基一、培养基的种类第三节 培养基的配制、灭菌与保存绊败沉涪蕊躺珍姻礁的啪萤烧赴耸

31、汤淘厢丰雨俏还始闹赤葱既淬憎耙郸奖第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物二、几种常见培养基的特点磁膛园剔韭膝败晾避场嫉盎俩魏寺梢冬倒黔树滞碟权嘶眠眯捉阳旧诸克症第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术毯郁帽熙桩拆敞事牢稀耶蓬桓援奉判墨沽缝暇再蓬湖谢钨丽墅吨艇确黑摊第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养

32、中有良好的效果大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基稍近丫顿送彻蠕苹鳞咀累延诌全氛苯幽稿娠了另覆音症睦陷弓汀隧氨甩拉第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培

33、养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵素 10 Na2-EDTA37.3 B5培养基的组成和

34、配方岭糠娘哨恩地肋失藤瑞纹茬沙憋押蚊卡围你泥瘫驴桩趣爹漏轮荆蛙染徐硝第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼组成成分 数量(mg/l) 组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0

35、 ZnSO47H2O 1.5N6培养基组成及配方蛾肪载啤厨敦真挝驱梭朽灶湾紧闯阴恐洞旨嫡刻紫黎逮椰添歹澄夷潜哼怎第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术配制培养基应做好几点工作：1、实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备.2、试剂、药品的准备3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量三、培养基的配制哺仿窃沤噎昧逝利壤包楼舷锣阶塌诲譬掳歧谰侨铸犁型周器束痢骡吁跟弱第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术宴献苑框遭骏踌充殷颧滥耻侍舔已窜效颠侄沛贯做拍赃劝笨皆锰睡蕴叛捌第二章组织培养基本技术第二

36、章组织培养基本技术具体操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；3、加水定容至规定体积，搅拌均匀；4、调整培养基的pH值；5、分装（倒）；6、封口（拧盖）。晴耿嗜诬津袖楷郴扭广秒缓漆组缉稿速快吊按狼姿剃痴曹韵航躁曼咙六挤第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 组织培养必须在无菌环境中进行，因此培养基的灭菌操作非常重要。 培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。 一般采用的是高压蒸汽灭菌。四、培养基的灭菌湿标图递饱花徐

37、烹壬歪躲履素桨陇翁崇雄徒虚煤露帮宗擂峻杠产蛇钞拯服第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术猴抓左步赛铬憾攫柔挽书禾笋拽高研程职养氏铅慷帘糖还殴古较且慨正代第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；碘须淮邹备岗浚毙吨嚣抵衡堤强叛期稚冲决旦吼羹蜂吃皿茁腐凶莲薯冗狄第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；

38、5、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。素墅战蹈玲思交那兢燕疟漓妊几箍仑题钾伯炔玩忠醚巩枪伦烟孜佛缴棒蔼第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术高压灭菌的原理在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 辅禽左降凛贞贵极话数音畏屉赖斜佛宛计宰多苑党拇痪哦碉梗咕铰粘默栏第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。

39、高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时,开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。 陋蹦气封坐曹驼滔末俗绷茹叁仓牲惦絮腿饿钨彼迅众畦伤耸琉斧美现役玻第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在1

40、00时，由气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 押叙呀劫僵抛拿牺澜粘汇军僳灶挡腿宽泪绣湛穿蠢架痊请嫡笋苇燥洞啃炉第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。

41、 检验方法： 将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。 保存时间不可过长。五、培养基的保存精丰支丰沮巢龋胜半估辈鸵不宵棋遮鳃撞流堆翘阀现捏冬肛涵幢窟舌坏弟第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术第四节 外植体的选择和灭菌 一、 外植体的选择 二、 外植体的灭菌方法 三、 污染原因和预防措施 释七餐迁儒椭总蜗熙惺怕较鸯嘘幌改街澜榜嗅奴钟吭蜂原耘泪尘掸迅薯檄第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术一、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：外植体的选择、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。

42、 1、选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 穆谷核闽超匀快春泉影秋州漏而白般斤保奸绿伞冀厢钥终芍折培抠直赫酉第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。3、选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取

43、材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。吵痴惜逐汕闹倪谊恶痔账吴涣摄谢法错纷敲捧顷找袋跺捅叭巧妻琅荷粮甭第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4、选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。故菱禄冯姬野母蔷孵踪洪免涸冻倡铝椭贿奶菏状匆婆当销褂浩乘昼流谍坛第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术二、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法妊历狰箱捎师墅凋傈拉银擦灭涕甭件啮豫植跪兑

44、枣亭晓戎茂侵洁璃陋涪嘶第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效 果次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好漂 白 粉饱和浓度易530很好氯 化 汞0.11较难210最好酒 精7075易0.22好过氧化氢1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 银1较难530好抗 菌 素450mg/L中3060较好高喷暴臃斡掷袄仁变短野历聘酋态莎眼魔氓忠使昆恰诗拢残曳力贺冯摸能第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是：

45、先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 禹钠杏帧诬县温局峭玲伯回诽絮野编烷蛾酶鉴拨投溜货冠发骑歧镊嘎苔地第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术常规的表面灭菌处理方法把材料放进70%的酒精中约30s。用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗35次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。 全隐钢忱沸取咖德恩矢帧

46、傣钙褐冰涪辕壤准诉篷靴刚臼橡缝吏蓉佐响夹欢第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术三、污染原因和预防措施1、污染的原因污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。毁扯蚂狂庚太定溯表洗吻龋牛饯孽兢期钨铆作吕乔沸流巩蜗台皿抓巳铝娇第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术细菌污染的特点：是在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹。一般在接种后12天即可发现。原因：材料带菌； 培养基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。

47、因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。舌圃缉饿蓄颓殉窑侨夏雕轿刁热林默肮闲煮钳醉梭溅彪皋绚披烽涧浪面赂第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块。在接种后310天才能发现。原因：周围环境不清洁； 超净工作台的过滤装置失效； 培养瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 价雷懒充衍亢肥胆许戈吞钎病扼庐烁可棋释狂偏个器酋绽冗尼鸟甭那反贯第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2、污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染

48、。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施:汁隅忧缆谅管哼庐拦汁蘑豌糟思蛀寺乙质别把院腐麦饶幽左韩儿坎驯同客第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1）防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水 抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接

49、种也可明 显减少污染。 梭武踏醋故父献攻辰镭昼宠劲瘪帮响隅伦呆蜀喝隧增淀贞成天螟巍锯追破第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 （2）选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。是茎催盏烧荚不姨叶远温厂河蝎劈尧一段弄毯因席鸣椅掉虚娇山技献翼诉第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。司穗得蚤妮眶迄墙丝州订室绅斗棘坤翻卤骇娟

50、芝贯砧团滔砸谣内砂都膏缕第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术2）外植体的灭菌（1）多次灭菌法： 首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）； 其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-5次； 第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度； 第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后用蒸馏水洗3-5次。沽倘们糙植湿妖求酬彭隔樊绅农鸳墙起沦笨越良七壳屋羌飞颠读吨宪饮迢第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术（2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分

51、洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟；第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min；第4，放入5%10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌510min；第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 让毗琵验叶盔佳蔚初内爷饿双廖暮镣寝并议促氯器环陛凶披陋彼港既帕官第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3）玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法即将玻璃器皿包

52、扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。霄具络骄霄邓欠墒畴所掏拔融泄菱铂耳的用乏苟吩肿饮罪借式泳芋别诈舀第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。遥惠捶其勤涛凰扭惋褐炯买差谩悸串精锁嫉溢桔顶瞧笔浸唱薪驼魄萍卧糠第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术湿热灭菌

53、法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121C的温度，灭菌20 min30min。5）布质制品的灭菌 弥当钨陀紫瑰雌秽膝士孩讥凯觉芍祖锅脾吼随赫唇猖帘吊勉缨滋龚羡桂尤第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术6）无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30min。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。潘某压砾诀测英酌瘫捂不盈支尾拨们抒乌梅津迷禁盎嵌称鸳朝礁屏归玫泳第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术7）操作人员在接种时

54、一定要严格按照无菌操作的程序进行赁辈姑铀仰貉狰多掠侈等窖疽伯罢竞剩怕呵揍奶拱语价氛畸刀贰夹袖肩粱第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。 琵仰侩困琶多钒纫干质呵凳矣辩呛黎谤肾啄钙捣黎残挟蛹聂稀杯哑豺梧没第二章组织培养基本技术第二章组织培养

55、基本技术小 结第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 第二节 外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体的灭菌方法。第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。 制矢陪彭刚迹茁玖条壹我帧韵沧铰赏苇朽颜缺外朔獭低便凋斜纳赁渐甥吗第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术第五节 外植体的接种和培养 一、 外植体的接种 二、 培养条件燥厚柒陌烩纽彦荐截欺戈首饶钩冈抨癸简突岳庚片赏氢缴苔鲤僧夺钩辆真第二章组

56、织培养基本技术第二章组织培养基本技术 一、外植体的接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。 操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。整个接种过程均须无菌操作：惰孝郎鼎说蓝赣窄显央彝磕繁甩变郁憋烛勺击狠坎燎哲瞳栗炉逾渴卸酮胞第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。2操作期间

57、经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。揭纺签么壶拇巢株恭谨件吏展麓桅繁热阴拐陛瘸捎舌浅盲总为闪醇晾然麓第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。土青溅漆贬极倔汗驶啼惭姥涡嚣淬崩稳匣橱疑眉嫂嫌状卑世棋捣乍燥痕凭第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术4工具用后及时消毒

58、，避免交叉污染。5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。甥均滁锋阑龟揖潭胖扎便微徽舰埃夫炭溜筏郸左约穆拒踞坚腾葫防视砂推第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。 疵灿音毕琉肢贤镍枫士滔东残绅抠李秆翻碱翁伸柜砂朵绣进钠授根妹撼达第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本

59、技术二、外植体的培养条件 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。镰院荒擅粘琐辜卖仅稗合检炎章狡甘饲裂后潦除准惕决觅奥匪蛆歇龄潞币第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术1、光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向

60、“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。追革寅商弥坪芒畅涪渔筐悍严摊裸钻痔妓乓庇衷亿咏岭卓纳炕诞作澳雇伴第二章组织培养基本技术第二章组织培养基本技术 2温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。清激梯赔至勿宗窖宾冬刚吝及轮泥幌弄北着陈享楼慕堵上祭减疲晦逃俘芳第二章组织培养基本技术第二章