高原缺氧的细胞及分子机制final课件

1、高原缺氧的细胞反应及分子机制第三章第三军医大学高原军事医学系高原生理学与高原生物学教研室谭小玲1代偿性反应 细胞对高原低氧的反应知识回顾损伤性变化氧利用的能力增强：尽可能利用多一点氧无氧酵解增强：尽可能产生多一点ATP肌红蛋白增加：尽可能储备多一点氧低代谢状态：尽可能多节约一点氧细胞膜损伤：膜蛋白功能障碍、细胞水肿 线粒体损伤溶酶体损伤：广泛的细胞损伤、2Oxygen homeostasis 通过呼吸循环系统对氧的摄取和运输，哺乳动物细胞氧分压维持在一个狭小的范围内，称为氧平衡。 It impacts on many aspects of cellular and systemic physi

2、ology, including : Redox state Energy metabolism Cardiovascular Respiratory Neuroendocrine function Hematopoiesis 33-22mmHgOxygen GradientsBloodInternal organs110mmHgAirAlveolarLarge arterialSmall arterialVeins100mmHg40mmHg150 mmHg 21% O2氧降阶梯Physiological oxygen concentration in vivo（Extracellular）L

3、arge arterialSmall arterialP02 30-40mmHgP02 50-60mmHgFrom Kerger H ,et al. Am J Physiol.1996 Mar;270(3 Pt 2):H827-36细胞内氧的利用（Intracellular）细胞线粒体羟化酶等氧合酶等其它90%10%6Oxygen gradient around mitochondriaIntra-mitochondria:PO2: 3.8-22.5mmHgPO22mmHg,inhibitedPO21mmHg,blocked7本章教学内容第一节 低氧感知第二节 缺氧与基因表达 第三节 缺氧与细

4、胞增殖第四节 缺氧与细胞坏死和凋亡8教学要求了解：1.参与急、慢性缺氧反应的病理过程和反应方式； 2.氧感受器的本质和作用机制的几种假说。理解：1H2O2、Ca2+、蛋白激酶和HIF-1在低氧信号转导中的作用； 2理解缺氧对细胞增殖的作用和缺氧时细胞增殖的机制； 3理解缺氧诱导细胞凋亡和细胞坏死的触发因素和机制。掌握： 氧感知、氧感知器、HIF-1和缺氧反应基因的概念和种类。 9第一节 低氧感知 Oxygen Sensing Under Hypoxia 10指机体从器官、组织到细胞分子水平对低氧的感应及反应过程。低氧感知（Oxygen Sensing）低氧感知的要素： 氧感知细胞氧感知器（分子

5、水平）信号传递途径效应或效应分子11急性反应和慢性反应急性反应：快速反应体系 快反应细胞 功能变化，不伴随结构变化慢性反应：结构变化 所有细胞 基因表达的变化NormalHypoxiaNormalHypoxiaVascular remodelingcardiac remodeling12 1、氧摄取系统：肺摄氧及肺血液氧合 2、氧运输系统：血液运载氧 3、氧分配系统：血流、血管的构型及功能状态 4、氧利用系统：细胞一.氧感知细胞机体缺氧反应体系These O2 sensing tissues or cells seem to have two general features in commo

6、n: (1) they have the capacity to directly transduce a hypoxic stimulus into a physiological response(2) there is little or no consensus regarding the actual mechanism that directly couples PO2 (or O2 concentration) to the initial effector response, i.e., the “O2 sensor.”131.氧感知细胞的分布部位细胞氧摄取系统气道神经上皮小体

7、 肺动脉平滑肌和肺血管內皮细胞 颈动脉体和主动脉体氧运输系统肾小管周间质细胞氧分配系统血管平滑肌和内皮细胞肾上腺嗜铬细胞氧利用系统一般工作细胞14气道神经上皮小体（neuroepithelial body，NEB） 氧摄取系统氧感受细胞（A）增强肺通气维持肺通气-血流比例增强心功能缺氧氧摄取能力增强神经递质；肽类和胺类物质15肺动脉平滑肌肺血管内皮细胞氧摄取系统氧感受细胞（B）维持肺通气-血流比例缺氧氧摄取能力增强肺血管收缩NormalHypoxia16主动脉体和颈动脉体氧摄取系统氧感受细胞（C）呼吸加深加快缺氧PO2下降氧摄取能力增强颈窦神经呼吸中枢CB:Carotid body17氧运输系

8、统氧感受细胞肾小管周间质细胞EPO生成增多 造血系统 红细胞生成增加 缺氧氧运输能力增强18氧分配系统氧感受细胞（A）血管平滑肌和内皮细胞VEGF表达血管增生 缩短氧的弥散距离 缺氧19氧分配系统氧感受细胞（B）肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺分泌增多 调节血管舒缩状态血液重新分配 缺氧保证生命重要器官的氧供20氧利用系统氧感受细胞细胞改变基因表达，如糖酵解增强降低与细胞生存无关的机能活动 缺氧减少氧耗；提高氧的利用效率21 皮肤能感知缺氧吗？Frontier field 222. 氧感知细胞分类主动脉体和颈动脉体，肾上腺嗜铬细胞，气道神经上皮细胞快反应细胞慢反应细胞快慢整体或局部性多为细胞自身分泌神经

9、递质或体液因子基因表达的变化举例种类反应速度影响作用方式机体的绝大多数细胞，如骨骼肌根据缺氧对细胞膜电位的影响特性分类23二、氧感受器与缺氧信号转导氧感受器（Oxygen sensor）讨论：作为Oxygen sensor，应该具备哪些特点？Oxygen sensorO224 1. 氧感受器 Oxygen sensor 1.1 血红素蛋白学说 1.2 NAD(P)H氧化酶复合物学说 1.3 线粒体学说 1.4 氧敏感离子通道学说 1.5 氨基酸羟化酶学说（脯氨酸羟化酶学说） 1.6 H2S .251.1 血红素蛋白学说261.1 血红素蛋白学说血红素蛋白 一系列含有卟啉环配体的蛋白质，如血红蛋

10、白、细胞色素aa3、p450、含细胞色素b558的辅酶氧化酶（NADPH）等。感受途径： 2结合于血红素分子中央的Fe2+，引起血红素蛋白构象变化发挥氧感受作用。 27证据：缺氧与 CoCl2、去铁剂处理之后， Hypoxia, cobalt chloride, and nickel chloride appear to stimulate Epo production through a common pathway: 1. The inhibition of Epo production at low partial pressures of oxygen by carbon monoxi

11、de provides evidence that a heme protein is integrally involved in the oxygen-sensing mechanism. 2. Further support is the finding that when heme synthesis is blocked, hypoxia-, cobalt-, and nickel-induced Epo production are all markedly inhibited. 28问题是：构像变化如何作为信号向下传递的?缺氧时血红素蛋白的合成是下降的。血红素合成抑制剂不能阻止细

12、胞对缺氧的反应血红素蛋白的种类很多，那一个或一类起关键作用？291.2 NAD(P)H氧化酶复合物学说NAD(P)H oxidase (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase) : a membrane-bound enzyme complex. This enzyme belongs to the family of oxidoreductases, specifically those acting on NADH or NADPH with oxygen as acceptor. Six subunits:1. Rho gu

13、anosine triphosphatase (GTPase), usually Rac1 or Rac2 (Rac stands for Rho-related C3 botulinum toxin substrate) 2. Five phox units. (Phox stands for phagocytic oxidase.) gp91-PHOX (contains heme)(Nox2) p22phox p40phox p47phox p67phox 301.2 NAD(P)H氧化酶复合物学说Substrates: NADH, NADPH, H+, and O2Products:N

14、AD+, NADP+, and H2O2.(1) Fe2+ + H2O2 +H+ Fe3+ + HO + H2O (2) Fe3+ + H2O2 Fe2+ + HOO + H+ Oxygen-dependent chemical reactionFenton reaction and free radicals31但是：gp91-PHOX (contains heme)(Nox2) 突变，对颈动脉体缺氧反应性没有影响321.3 线粒体学说 1.氧消耗的主要位点2.ROS产生的场所3.电子传递链（ETS）上有许多酶含有血红素，如细胞色素4.ETS抑制剂导致细胞缺氧5.缺氧首先抑制线粒体电子传递链

15、功能，并引起内膜去极化，触发细胞游离Ca2+增多和儿茶酚胺分泌增多。 33ETS抑制剂主要作用于细胞色素1.3 线粒体学说Cyt592：与O2的亲和力极低，其氧化还原转态对缺氧十分敏感。34但是：0细胞：去线粒体DNA的细胞 是指一类线粒体内DNA 缺失,无线粒体功能,依靠糖酵解存活的细胞系。1.保持缺氧刺激反应2.保持缺氧刺激的HIF表达线粒体DNA编码蛋白：35Corneille Heymans，BelgiumHeyman1.4 氧敏感离子通道学说1938年的诺贝尔奖36离子通道氧感受机制缺氧神经中枢兴奋神经递质释放钙离子内流电压门控Ca2+通道打开膜去极化抑制氧敏感 K+调动心肺功能1.

16、4 氧敏感离子通道学说Physiol Rev 2010; 90 :675-754371.4 氧敏感离子通道学说381.4 氧敏感离子通道学说1.哪个或哪种离子通道起主要作用？ 离子通道种类多：384？ 氧敏感的离子通道？2.离子通道在不同细胞中表达种类均不同。3.氧敏感钾离子通道是研究最多的，但其氧敏感的机制不清楚。Proposed ion channel O2 sensing in NEB391.5 氨基酸羟化酶学说缺氧诱导因子Hypoxia Inducible Factor，HIF4041脯氨酸羟化酶 (PHD)PHDsHIFs缺氧相关基因表达Am J Respir Crit Care M

17、ed, 2011,183:152-1561.5 氨基酸羟化酶学说42氨基酸羟化酶FIH降低HIF-1转录活性:阻断p300的结合1.5 氨基酸羟化酶学说43 在常氧时HIF-l不稳定是由于其中脯氨酸被其羟基化酶(PHD)羟化成羟脯氨酸，使HIF-1的赖氧降解域(Oxygen dependent degradation domain, ODD)结合于一种抗癌基因表达的蛋白质(pVHL)，经泛素蛋白酶体途径降解；另一方面，HIF- 1中的天冬酰胺被其羟化酶(FIH- 1)羟化成氢化天冬酰胺，通过阻碍HIF-l与转录辅因子p300等结合而使HIF-l活性下降。低氧时该羟化酶活性降低，HIF-1中脯氨

18、酸和天冬酰胺不被羟基化，故稳定而不被降解，使细胞中HIF-1增多，活性增高，上调基因表达，引起细胞的缺氧反应。 1.5 氨基酸羟化酶学说441.5 氨基酸羟化酶学说慢性或长期缺氧反应中的氧感受器之一45 氧感受器oxygen sensor 1.血红素蛋白学说 2.NAD(P)H氧化酶复合物学说 3.线粒体学说 4.氧敏感离子通道学说 5.氨基酸羟化酶学说 6. H2S .46H2S 氧感受器oxygen sensor 47Comparison of H2S (total sulfide) and O2 concentrations in homogenized cow lung (left p

19、anel) and sea lion lung (right panel) measured in real time.48颈动脉体缺氧HO（亚铁血红素加氧酶）COBK静息膜电位兴奋性窦神经呼吸/心跳中枢J Biol Chem,2010, 285(26):2011720127. Science, 2004, 306:209397氧感受是多途径的综合过程49NEB氧感受是多途径的综合过程50氧感受的特点1.细胞组织差异性2.与缺氧时程相关 急性缺氧 慢性或长期缺氧3.综合作用SUMMARY512.低氧信号转导 1.活性氧2.Ca2+3.腺苷.第二信使MAPKAMPK.信号转导途径522.1 第二

20、信使2.1.1 Reactive oxygen species,ROSH2O2可间接激活鸟苷酸环化酶，增加cGMP的水平。而cGMP抑制低氧敏感基因的表达。 H2O2与细胞内的铁离子作用，通过Feton反应，产生OH。OH可与蛋白质分子上的巯基相互作用，影响蛋白质构象。如HIF-1的构象发生改变，激活其结合DNA的活性，促进低氧敏感基因的转录表达。 chemically reactive molecules containing oxygen532.1.2 Ca2+Ca2+是传统的第二信使。低氧时细胞内游离Ca2+增加，激活与钙相关的信号通路，调控一些低氧敏感基因。偶联氧敏感的K+离子通道氧感

21、受器2.1 第二信使542.2 缺氧信号转导通路AMPK“细胞能量调节器”：AMP/ATP比值AMP激活的蛋白激酶，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类2ADP ATP +AMPA: AMPK 结构模式图; B: AMP 激活的AMPK 模式图参与基因表达信号转导：1.基因敲除小鼠的研究表明, 骨骼肌AMPK 表达缺失可使234 个基因表达上调和130 个基因表达下调超过2倍；2.阻断AMPK 活性将减弱缺氧诱导反应, 如: HIF-1 目标基因的表达、血管内皮生长因子的分泌、葡萄糖摄取和HIF-1 依赖的报告基因表达55SUMMARY了解：1.参与急、慢性缺氧反应的病理过程和反应方式； 2.氧感受器的

22、本质和作用机制的几种假说。理解：1H2O2、Ca2+、蛋白激酶和HIF-1在低氧信号转导中的作用； 2理解缺氧对细胞增殖的作用和缺氧时细胞增殖的机制； 3理解缺氧诱导细胞凋亡和细胞坏死的触发因素和机制。掌握： 氧感知、氧感知器、HIF-1和缺氧反应基因的概念和种类。56缺氧氧感受器效应分子第二信使信号转导基因转录/翻译调控基因表达 细胞生长细胞增殖细胞分化细胞调亡细胞坏死细胞存活，等离子转运膜去极化/超极化血管收缩神经递质分泌，等hemoproteinNADPH oxidasemitochonriaIon channelPHDs第二节 缺氧与基因表达57第二节 缺氧与基因表达缺氧反应基因(（h

23、ypoxia responsive gene，HRG)： 缺氧细胞通过位于细胞中的氧感受分子感受低氧信号后，引起下游的基因表达发生改变，这些基因称为缺氧反应基因，比较典型的是VEGF、EPO等。 58缺氧反应基因的表达转录因子（transcription factor,TF）缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)第二节 缺氧与基因表达59HIF-1复合体一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)HIF-1受氧浓度的调节HIF-1为组成性表达60全长HIF-1的结构bHLH、PAS : HIF-1与亚基HIF-1以及靶基

24、因序列DNA结合所必需的 NLSs: 核定位信号区TAD: 转录活化区ODD: O2依赖的降解功能区一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)61一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)功能调节62一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)功能调节 HIF-1的活化调节蛋白调节蛋白功 能PI3-K/Akt介导生长因子、致瘤因子导致的HIF-1蛋白稳定性增加MAPK抑制MAPK导致HIF-1蛋白量下降, DNA结合功能下降。其中ERK1/2 能磷酸化HIF-1HDM2能

25、与HIF-1直接结合，参与生长因子介导的HIF-1活化 mTORMTOR抑制物雷怕霉素（rapamycin）能抑制 HIF-1功能p300能与HIF-1直接结合，充当转录辅激活子Hsp90抑制Hsp90导致HIF-1功能下调NONO调节HIF-1功能（上调或下调与iNOS导致HIF-1 蛋白增加ROS促ROS生成因素能增加常氧条件下HIF-1蛋白的稳定性；线粒体 ROS 增加能促进HIF-1蛋白的稳定63调节蛋白功 能PHDs使HIF-1脯氨酸羟化酶，导致VHL结合，进入蛋白酶体降解途径VHL与脯氨酸羟基化的HIF-1结合，具有E3 连接酶功能，使HIF-1进入蛋白酶体降解途径；能与HDACs

26、 结合，抑制HIF-1的转录激活功能功能FIH-1HIF-1抑制蛋白HIF-1 天冬氨酸羟基化，通过破坏HIF-1-p300ARD1使HIF-1的赖氨酸乙酰化，促VHL-HIF-1的结合CITED2/CITED4抑制HIF-1a p300结合HIF-3a/IPASHIF-1的显性负调节蛋白，能与结合，抑制dnHIF-1无DNA结合区、转录激活区、和短肽，能显性负调节的方式抑制有功能的HIF-1复合体的组装p53能与直接结合，抑制的稳定性及转录激功能GSK3h体外可磷酸化的HIF-1共分布的特点，在长时间缺氧条件下表达上调。FOXO4过表达导致HIF-1 下调p14ARF与HIF-1 ODD结合

27、;与共表达导致HIF-1 重新进入细胞核PTEN抑制PTEN使HIF-1活性增加，过表达HIF-1 下调一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)功能调节 HIF-1的活性抑制蛋白64HIF-1靶基因讨论：HIF-1靶基因的特点有哪些？一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)缺氧诱导表达HIF-1结合元件讨论：如何证明某个基因是不是HIF-1的靶基因？65#DAPIHIF-1MergeA-tubulin6hHIF-121%O221%O2+DFXSTC2BCHIF-1ControlshRNA1% O2 6h-t

28、ubulinSTC2#讨论：如何证明某个基因是不是HIF-1的靶基因？66HIF-1靶基因分类（classification）一、缺氧诱导因子1 (hypoxia induced factor 1,HIF-1)氧供应细胞代谢细胞生长与凋亡其它血管新生：VEGF红细胞增生：EPO糖酵解：磷酸果糖激酶葡萄糖转运：葡萄糖转运体1（Glut1）67二、其它转录因子AP-1NF-BCREBp53.68缺氧诱导转录因子的交互作用69氧感受小结缺氧氧感受器效应分子第二信使信号转导基因转录/翻译调控基因表达 细胞生长细胞增殖细胞分化细胞调亡细胞坏死细胞存活，等离子转运膜去极化/超极化血管收缩神经递质分泌，等h

29、emoproteinNADPH oxidasemitochonriaIon channelPHDs70第三节 缺氧细胞增殖与凋亡 在缺氧的作用下，不同类型细胞反应不一。有的细胞会出现增殖肥大，如肺血管平滑肌细胞（PVSMC)增殖、血管内皮细胞增生、成纤维细胞增殖、心肌细胞肥大等；相反，有的细胞则萎缩退化，甚至凋亡坏死，如缺氧性骨胳肌萎缩等。71一、缺氧诱导平滑肌细胞增殖肺血管平滑肌细胞具有两种表型:收缩型：胞浆内含丰富的肌丝，致密体及较多的-actin 。合成型：细胞胞浆中参与生物合成的内质网、线粒体及高尔基氏器含量较多，并分散存在一些肌丝束，缺乏收缩能力，但其移行、增殖以及分泌能力强。 缺氧肺血管平滑肌细胞分泌型-actin减少 细胞增殖72缺氧诱导细胞增殖的机制 缺氧促进细胞增殖因子释放 缺氧引起细胞增殖的细胞内信号转导 缺氧时细胞增殖的调控基因缺氧细胞增殖在细胞周期水平的调控 一、缺氧诱导平滑肌细胞增殖73缺氧可以诱导PVSM释放生长因子和细胞因子血小板源生长因子(platelet derived growth factor，PDGF) 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor， FGF) 上皮生长因子(epidermal g