环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立及其免疫功能的测定

1、环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立摘要:目的建立环磷酰胺对小鼠的免疫抑制的动物模型，从天然免疫功能和获得免疫 功能两方面检测对小鼠的影响。方法初次免疫设立实验组给予OVA-AL（OH）3（0.5/只） 和对照组给予NS（ 0.5/只）；8d,10d,12d,14d分别给实验组和对照组注射 NS和 CTX（100mg/kg）;与 15d 加强免疫分别注射 NS 和 OVA-AL（OH）3（0.5/只）；22d 检测免 疫功能结果与NS-NS组相比，CTX-NS组的SI值，双向免疫及ELISA的效价无明显 差别，但吞噬细胞指数及吞噬细胞百分率明显降低；与NS-OVA相比CTX-OVA组的SI 明

2、显降低，双向免疫剂ELISA效价都降低结论环磷酰胺对小鼠的T淋巴细胞，B淋巴 细胞以及吞噬细胞有抑制作用Abstract：aims To establish animal model of cyclophosphamide in mice immunosuppression , test in mice from two aspects of natural immune function and immunity function methods Primary immune to set up the experimental group given OVA-AL（OH）3 and The

3、 control group given NS ; the 8th,10th,12th,14th day give the experimental group NS and the control group CTX ,and the 15th strengthen the immune;the 22th test the immune function results Compared with NS - NS group, the SI value of CTX - NS group, bidirectional immune potency and ELISA has no obvio

4、us difference, but the phagocyte index and phagocytes percentage decreased obviously; Compared with NS - OVA CTX - SI of OVA group was obviously lower, bidirectional immune agent ELISA titer were reduced conclusion Cyclophosphamide in mice of T lymphocyte, B lymphocyte and phagocytes have inhibition

5、关键词：环磷酰胺CTX免疫抑制动物模型淋巴细胞建立一种环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，并将其与正常小鼠进行对照，通过检测小鼠的 天然及获得免疫功能对比其改变与不同，从而可知环磷酰胺对免疫抑制的作用，有利 于进一步进行对临床应用抗肿瘤的研究。1.材料与方法1.1材料1.11实验动物：ICR小鼠4只，雌性，2022g，清洁级，吉林大学实验动物中心。1.12重要器材：显微镜，离心机，超净台，细胞计数板，细胞培养箱，酶标仪，打孔 器，加样器（200p l,20p l），酶标板，EP管1.13实验试剂：CTXN西普德药业公司），生理盐水（NS），OVA+AL（OH）3，苦味酸, 培养液（IMDM）5%FCS,

6、ConA（10四/ml）,MTT（5四/ml）,白细胞计数液（2%冰醋酸）， 二甲亚砜（DMSO）,1.5%琼脂，PBS，洗液（PBS-Tween20），封闭液 BSA（0.5%1%的牛血清白蛋白），酶标抗体（HRP-GaM ），显色底物，终止液，3%鸡红 细胞悬浮液，3%淀粉溶液，Giemsa-wrights染液1.2方法1.21小鼠模型的建立：初次免疫设立实验组给予OVA-AL（OH）3（0.5/只）和对照组给予 NS（ 0.5/只）；8d,10d,12d,14d分别给实验组和对照组注射NS和CTX（100mg/kg）;与 15d加强免疫分别注射NS和OVA-AL（OH）3（0.5/只）；

7、22d检测免疫功能T淋巴细胞功能检测（MTT法）实验动物摘眼球取血后无菌操作取脾脏和胸腺，制备单细胞悬液，进行细胞计数，调细胞浓度至1x107/ml,培养48小时，加入 MTT，继续培养2小时，小心吸取上清，加入DMSO震荡是颗粒溶解，用酶标仪测定 吸光度值A570nm，结果测量：用酶标仪测定光密度值A570nm （用空白孔调零）， 记录结果。结果判定：SI（刺激指数）=Con A刺激孔A值/对照组A值B淋巴细胞功能检测双向免疫扩散法：实验动物摘眼球取血，分离血清。制备琼脂糖凝胶后进行铺胶，待 琼脂糖凝固后与载玻片上打梅花孔。将血清倍比稀释，稀释度为1:2,1:4,1:8,1:16 .与 梅花

8、孔中央加入Ag（ OVA 0.1mg/ml），周围的孔依次按顺序加入生理盐水，1:1， 1:2,1:4,1:8,1:16待测血清，放入湿盒，37 0C扩散24小时后记录结果。ELISA法：包被：用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原（OVA，10四/ml）稀释。 100 W/well加入聚苯乙烯酶标板中，4C过夜。封闭：弃孔内溶液。加入150 W/well 洗液，43 C 60mins。加样：弃封闭液，加倍比稀释的待测免疫血清100叫孔，43C 孵育40mins，孵育结束后，用PBS-T 3min/次。酶抗：酶标抗体，100l/well ,置43C 孵育40mins，用PBS-T 3m

9、in/次。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液 100|d/well，室温下避光显色。终止：加50 W/well 2M硫酸（终止液）。结果判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的最高稀释 度为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值（A ）,与阴性对照孔A 值相比其比值22 ,相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。1.24吞噬细胞功能测定 小鼠腹腔巨噬细胞鸡红细胞试验：实验前2天，给小鼠腹腔 注射3%淀粉溶液。给小鼠腹腔注射3%鸡红细胞悬液0.5ml，-小时后想腹腔打2ml 生理盐水，反复吹打后吸取腹腔液。取20p l加到玻璃板上，加Gie

10、msa-wrights染液 20p l静置2分钟盖上盖玻片显微镜下观察。结果判定：用40倍镜查找观察200个巨 噬细胞，计数其中未吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数、吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞数及被 吞噬的鸡红细胞数,计算吞噬百分率及吞噬指数。吞噬百分率=有吞噬作用的巨噬细胞数/计 数的总巨噬细胞数（200 ）x 100 % 吞噬指数=有吞噬作用的巨噬细胞吞入的鸡红细胞总数/计数的总巨噬细胞数（200 ） 2结果2.1淋巴细胞转化实验结果:对照ConASI对照ConASINS-NS0.5830.7211.2370.2340.2501.068NS-OVA0.2390.2861.1970.3470.9262.

11、669CTX-NS0.7910.8101.0240.1820.2041.121CTX-OVA0.2620.2360.9010.0410.0411.000CTX-NS与NS-NS组的刺激指数对比有增高和降低两种结果，结果出现误差。CTX- OVA与NS-OVA组对照组的刺激指数相对降低，可知CTX可抑制小鼠T淋巴细胞增殖 及转化的功能2.2双向免疫扩散法实验结果：NS-NS,CTX-NS,NS-OVA,CTX-OVA分别为 00 1:8 0除了 NS-OVA的效价结果为1 ： 8外其余均显示为阴性，可知CTX可降低小鼠免B淋 巴细胞功能2.3 ELISA法实验结果：NS-NS,CTX-NS,NS

12、-OVA,CTX-OVA 分别为 001:4096001:1280NS-NS组和CTX-NS组结果均为0，无特异抗原。与NS-OVA相比CTX-OVA的效价低, 说明CTX有明显降低小鼠B淋巴细胞功能的作用2.4吞噬细胞功能测定结果:NS-NSCTX-NSNS-OVACTX-OVA总巨噬细胞数200200200200未吞噬巨噬细胞数138184150154吞噬的巨噬细胞数62165046吞噬的鸡红细胞数997783118吞噬百分率31%8%25%23%吞噬指数0.4950.3850.4150.590与NS-OVA相比CTX-OVA组的吞噬指数增高，吞噬百分率升高，与前面的结果相较， 得出NS-

13、OVA组的实验数据出现明显错误，舍之。而与NS-NS组相比CTX-NS组的吞 噬指数降低，吞噬百分比明显降低，可得，CTX有明显降低小鼠吞噬细胞吞噬功能的 作用3.讨论鉴于实验数据的局限性以及实验操作过程中的失误以及实验结果的误差，对本次实验 结果进行如下分析：OVA与NS-OVA组对照组的刺激指数相对降低，可知CTX可抑制 小鼠T淋巴细胞增殖及转化的功能；双向免疫NS-NS,CTX-NS,CTX-OVA效价为0，NS- OVA 效价为阳性1 ： 8.尤与实验组CTX-OVA相比可知环磷酰胺对小鼠B淋巴细胞免疫 有抑制作用；ELISA实验NS-OVA的效价比CTX-OVA明显增大，可知环磷酰胺对小鼠 B淋巴细胞免疫抑制作用很强；吞噬细胞功能测定实验中，NS-OVA小组的实验结果由 于操作过程中出现了过错，结果明显有不正确之处，舍去不允与考虑，而NS-NS组与 CTX-NS组数据相比CTX-NS组的吞噬百分率明显降低，吞噬指数也降低，说明，CTX 对在没有抗原影响的情况下对小鼠的吞噬细胞吞噬功能仍有抑制作用。参考文献：高苴，钱嘉林，刘长喜，严卫星环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立 北京 环 境与职业医学2004年8月第21卷第4期唐超明，李汉贤环磷酰胺