抗原抗体反应及应用课件

1、第七章 抗原抗体反应及应用本章提要抗体的制备与应用抗血清的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体催化性抗体单抗的医学应用抗原抗体反应抗原抗体反应原理抗原抗体反应特点常见免疫分析方法沉淀反应凝集反应免疫标记技术补体参与的抗原抗体反应免疫分析灵敏度本章小结课后思考题2011春夏7.1.1 抗血清的制备抗原的准备免疫动物动物的选择免疫途径免疫剂量与周期动物采血法抗血清的纯化与保存抗血清的鉴定2011春夏抗血清与多克隆抗体抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细

2、胞产生的抗体，所以称为多克隆抗体。2011春夏抗原的准备半抗原与载体偶联制备完全抗原常用的连接反应及双功能连接剂佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化连接基团连接方法（连接剂）-NH2/-COOH碳二亚胺（EDC）法、混合酸酐（MA）法、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法-NH2/-NH2戊二醛法、SPDP法-NH2/-OH高碘酸钠法、琥珀酸酐法芳香胺基重氮化法-NH2/-SHMBS法、SMPT法、SMBT法2011春夏动物的选择抗原与免疫动物的种属差异越远越好。对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量

3、血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。2011春夏免疫途径一般采用多点注射，一只动物注射总数约为810点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答；静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。2011春夏免疫剂量与周期免疫剂量：抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.51mg/只，小动物约0.10.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，

4、再经23次以上的加强免疫，一般34周间隔适合大部分动物，小动物1014天，大动物2月左右。2011春夏动物采血法颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。2011春夏抗血清的纯化与保存试血、采血：加强免疫后23次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。保

5、存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4保存。2011春夏抗血清的鉴定效价鉴定：效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。亲和力鉴定：亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。抗体特异性鉴定：常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。2011春夏7.1.2 单克隆抗体的制备单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。单抗制备的原理单抗制备的材料单抗制备的技术单抗

6、制备流程图2011春夏单抗制备的原理MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。为使B细胞在体外能长期存活，Khler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。2011春夏单抗制备的材料骨髓瘤细胞：不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B细胞小鼠或大鼠脾脏融合剂50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲HAT选

7、择培养基含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640）2011春夏单抗制备的技术抗原提纯与动物免疫骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合HAT法筛选杂交瘤细胞阳性细胞的筛选、单克隆化与保存单克隆抗体的制备与纯化2011春夏抗原提纯与动物免疫抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠龄在812周，雌雄不限，可同时免疫34只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般23周。末次免疫后34天，取出脾脏组织，制成单细胞悬液。2011春夏骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备选

8、择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合时应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95）。在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，需加入饲养细胞，常用的饲养细胞为小鼠腹腔细胞，可用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出腹腔液即可，其中多为巨噬细胞。2011春夏细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，其基本步骤如下：骨髓瘤细胞与脾脏细胞混合（ 1:21:10 ）培养，培养液中小牛血清、各种离子和营养成分需严格配制，以保证融合效率；加入40（W/V） P

9、EG10002000使细胞融合；1min后滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml稀释，消除PEG的作用。2011春夏HAT法筛选杂交瘤细胞哺乳动物DNA合成的两条途径：salvage pathway替代合成途径胸腺嘧啶（T）胸腺嘧啶激酶（TK）次黄嘌呤（H）次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）核苷酸染色体DNAdo novo pathway从头合成途径磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶叶酸核苷酸氨基蝶呤（A）2011春夏阳性细胞的筛选、单克隆化与保存筛选ELISA、Dot-ELISA、凝集试验、免疫印迹、免疫荧光试验单克隆化有限稀释法荧光激活细胞分拣法（FACS）保存冰

10、冻保存，温度越低越好，研究显示，液氮保存的细胞株活性仅有轻微下降。2011春夏单克隆抗体的制备与纯化筛选出阳性细胞株进行抗体制备，有两种方法：增量培养法：即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体，如大瓶培养法、中空反应器法。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法：将杂交瘤细胞接种到弗氏佐剂处理的BALB/c小鼠腹腔中去，通常在接种一周后即有明显的腹水产生，抗体含量较高且杂蛋白较少，每只小鼠可收集510ml的腹水。单抗的纯化方法与多抗相同。2011春夏7.1.3 基因工程抗体基因工程抗体是利用DNA重组技术，在基因水平上对Ig分子进行剪接、修饰，甚至是人工合成后导入受体细胞表达，而制备的一种新型

11、抗体。根据基因工程抗体的结构不同，可以分为：人鼠嵌合抗体改型抗体双特异性抗体小分子抗体基因工程抗体的结构与特性2011春夏人鼠嵌合抗体结构：鼠源V区或Fab人源C区或Fc制备：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。2011春夏改型抗体结构：将鼠单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，故又称CDR移植抗体。特点：抗体CDR直接决定抗体的特异性，改型抗体使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。2011春夏双特异性抗体结构特

12、点：由异源性的H2L2构成，具备结合两种不同抗原的特点，又称双功能抗体。制备：将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及Ig类型表达。应用：将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易杀伤肿瘤细胞。2011春夏小分子抗体源自抗体且保持抗原结合能力，但不具备完整抗体结构的一系列小分子。典型的小分子抗体有：单链抗体scFv由VH连接肽VL组成，它质量很小，作为异种蛋白抗原性较小，组织穿透力强，是目前研究最活跃的基因工程抗体之一，可用噬菌体转染细菌大量制备。其他小分子抗体还有：Fab、Fv，单域抗体（VH），最小识别单元（CDR）等。2

13、011春夏基因工程抗体的种类及其特性种类基本结构相对分子质量(kD)鼠源性成分人鼠嵌合抗体鼠源V区/Fab人源C区/Fc15025%30%改型抗体以鼠源CDR替换人源CDR15015%双特异性抗体异源性H2/L215033小分子抗体Fab完整L链和部分H链5015%FvVH非共价连接VL2515%单链抗体VH连接肽VL2615%单域抗体VH12.57.5%最小识别单元单一CDR21.5%2011春夏7.1.4 催化性抗体一种具有催化化学反应活性的抗体，又称抗体酶（abozyme），表现出对底物立体结构的专一性，催化的化学反应特异性高于酶，效率低于常规酶类。通过设计稳定的转换态类似物作为半抗原，

14、与载体蛋白交联后免疫动物，可制备催化性抗体：先筛出与底物或半抗原结合的抗体，再从中筛出有催化活性的抗体；对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性。2011春夏7.1.5 单抗的医学应用单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于各类病原体的诊断，这是单克隆抗体应用最多的领域。对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测，用于肿瘤的诊断、分型及定位。2011春夏检测淋巴细胞的表面标志，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。应用单克隆抗体和免疫学技术，

15、可对机体的多种微量成分进行测定，以便判断健康状态、检出疾病、指导诊断和治疗等。鼠源性单抗作为体外诊断试剂是满意的，但用于人体可能会引起过敏反应甚至危及生命。目前虽然已通过人鼠细胞杂交及人人细胞杂交进行了一些探索，但还不能商品化生产，因此制备人源单克隆抗体是目前亟待解决的问题。2011春夏7.2.1 抗原抗体反应原理抗原抗体反应可分为两个阶段：抗原与抗体发生特异性结合，此阶段仅需几秒至几分钟，不出现可见反应。可见反应，此阶段抗原抗体复合物在环境因素的影响下，进一步交联集聚，表现为凝集、沉淀、中和、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。抗原抗体反应原理：抗原抗体间的作用力亲水胶体转化为疏水

16、胶体2011春夏抗原抗体间的作用力抗原和抗体通过非共价键结合，两者间涉及多种弱的分子间作用力：静电引力、范德华力、氢键作用力、疏水作用力等。抗原抗体间结合力表现为：亲和力（affinity）：单价抗原与抗体间结合力的强度，表现为抗原抗体反应平衡常数；亲合力（avidity）：多价抗原与抗体间结合力的总强度，表现为多个亲和力的加成。2011春夏亲水胶体转换为疏水胶体亲水胶体：抗体和大多数抗原都是蛋白质，蛋白质亲水的氨基羧基周围可形成水化层，再加上同种电荷相斥，就形成了稳定的亲水胶体。疏水胶体：当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；且抗原抗体结合后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏

17、水胶体。各疏水胶体进一步靠拢，形成可见的抗原抗体复合物沉淀。2011春夏7.2.2 抗原抗体反应特点抗原抗体反应是指抗原与对应抗体在一定条件下特异结合，形成可逆性抗原抗体复合物的过程。此类反应的规律和特点有：特异性可逆性比例性2011春夏特异性特异性是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体发生反应。因为抗体CDR与抗原决定簇在化学结构和空间构型上呈互补关系。这种高度的特异性在传染病的诊断、防治等医学和生物学领域都已得到了广泛的应用。大多数天然抗原物质的构成复杂，常含有多种抗原决定簇。如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应（cross

18、 reaction）。2011春夏可逆性可逆性是指在一定条件（如低pH、高浓度盐等）下，抗原抗体复合物分子间作用力减弱而导致解离，回复到抗原与抗体的游离状态。抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为：抗原抗体反应平衡取决于两个因素，一是抗原抗体亲合力大小；二是环境因素对复合物的影响。2011春夏比例性比例性是指多价抗原与抗体反应，只有当二者浓度比例适当时，才形成大的抗原抗体结合物，产生凝集、沉淀等可见反应。把最迅速出现可见反应时的抗原抗体的浓度比或量比，称为抗原抗体反应的等价点（equivalence point），抗原与抗体比例最合适的范围称等价带（equivalencezon

19、e）。Marrack提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制。2011春夏网格学说当多价抗原与多价抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成较小复合物，不能出现可见反应。2011春夏7.3.1 沉淀反应在体外当抗原与相应抗体浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应，广泛用于抗原或抗体的定性及定量分析。根据反应介质和检测方法不同，沉淀反应可分为以下几种类型：液相沉淀反应凝胶扩散沉淀免疫电泳试验免疫共沉淀2011春夏液相沉淀反应指以含盐缓冲液为反应介质的抗原抗体特异性结合的沉淀试验，可分为3类：絮状沉

20、淀试验：抗原抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，出现可见的絮状沉淀。环状沉淀试验：将抗原溶液叠加在细小玻管中抗体溶液上面，在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环。主要用于鉴定微量抗原如鉴定血迹，诊断炭疽。免疫浊度试验：根据抗原抗体反应后溶液浊度变化测定未知抗原或抗体浓度。2011春夏凝胶扩散沉淀琼脂或琼脂糖凝胶内部是一种大孔径网状结构，抗原和抗体在凝胶中可自由扩散。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇形成复合物，若两者在相遇处比例适当，则复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状。根据抗原抗体反应的方式和特性可分为：免疫单扩散试验免疫双扩散试验2011春夏免疫单扩

21、散试验原理：定量抗体混匀在琼脂凝胶中，加待测抗原溶液使其单独在凝胶中扩散，形成沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正比。技术要点：将抗体和0.9%琼脂50-56混合制成平板；凝固后在其上打孔，加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品；37自由扩散24-48小时，孔周围出现沉淀环，测定沉淀环直径。2011春夏免疫双扩散试验原理：将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的沉淀线，可检测抗原或抗体的特异性。技术要点：在平板玻璃上倾注一均匀的琼脂凝胶薄层；打制23mm的小孔，分别加入抗原或抗体；温育12天，可出现不同沉淀线。2011春夏

22、免疫电泳试验免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，有两大优点：大大加快了沉淀反应的速度；将某些蛋白组分根据带电荷的不同而分开，再与抗体反应，从而使本法更为微量化，多样化，使其应用范围日益扩大。常用技术有以下几种：血清免疫电泳（IEP）火箭免疫电泳（RIEP）对流免疫电泳（CIEP）2011春夏血清免疫电泳（IEP）步骤：电泳分离抗原；在抗体槽内加入抗血清；扩散形成肉眼可见的弧形沉淀线。应用：已知抗血清，根据沉淀弧的数量，位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及性质。固定抗原，根据沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清的差异，即血清组分的缺少或增加。2011春夏火箭免疫电泳（RIEP）一种通过

23、电泳进行加速的单向免疫扩散技术，由于其沉淀形似火箭，故称为火箭免疫电泳。在混合有抗体的凝胶上做孔，加入抗原电泳，沿电泳方向随着抗原量的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭型沉淀线，沉淀线高度与抗原量成正比，可定量检测特定血清蛋白含量。2011春夏对流免疫电泳（CIEP）又称电渗析，实质上是定向加速的电泳技术与免疫双向扩散技术的结合。原理：在PH8.6的琼脂凝胶中，抗体带微弱的负电且较大，电泳力小于电渗力，泳向负极；而一般抗原电泳力大于电渗力，泳向正极。电泳时抗原放负极侧孔，抗体放正极侧孔，抗原抗体相对泳动在两孔间相遇，比例合适时形成沉淀线。有微量快速特点，常用于医学检验。2011春夏免疫共沉淀以抗原

24、和抗体之间的专一性作用为基础，研究蛋白质在完整细胞内互作的一种免疫学方法。原理与应用：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质间互作会被保留。如果用某蛋白的抗体免疫沉淀，与该蛋白在胞内结合的蛋白质也会随之沉淀。常用于测定两种目标蛋白质是否在胞内结合，也可用于确定一种特定蛋白质新的作用搭档。2011春夏7.3.2 凝集反应凝集反应（agglutination）是指颗粒性抗原或表面覆盖抗原（或抗体）的颗粒状载体，与相应抗体（或抗原）结合，在一定条件下，形成肉眼可见的凝集团块现象。根据技术方法差异，凝集反应可分为：直接凝集试验间接凝集试验抗球蛋白试验协同凝集试验冷凝集试验2011春夏

25、直接凝集试验细胞等颗粒性抗原在有电解质的参与下，直接与相应抗体结合出现的凝集现象。凝集原：凝集反应中的抗原凝集素：凝集反应中的抗体常用的直接凝集试验有玻片法（定性）和试管法（定量）。2011春夏间接凝集试验用人工方法将可溶性抗原（或抗体）吸附或偶联于载体上，使之成为致敏载体颗粒，在电解质参与下与相应抗体（或抗原）作用产生凝集现象。载体：试验体系中与免疫无关的颗粒。致敏：抗原或抗体偶联于载体表面的过程。致敏颗粒：吸附有已知抗原或抗体的颗粒。根据致敏用的试剂和反应方式可分为：（正向）间接凝集试验反向间接凝集试验间接凝集抑制试验2011春夏用特异性抗原致敏载体，检测样本中的相应抗体，如病菌感染产生的

26、抗体，自身免疫疾病、变态反应患者抗体等。正向间接凝集反应2011春夏反向间接凝集反应用特异性抗体致敏载体，检测样本中的相应抗原，可检测HBsAg、细菌荚膜抗原等。2011春夏间接凝集抑制试验（阳性）用抗原致敏载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测样本中是否存在与致敏颗粒相同的抗原，不出现凝集颗粒表示阳性。2011春夏间接凝集抑制试验（阴性）有凝集颗粒出现表示阴性待测样本中不存在与致敏颗粒相同抗原。妊娠检测试验2011春夏抗球蛋白试验原理：机体受某些抗原刺激后产生不完全抗体，其与相应抗原结合后不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合，故又称“封闭抗体”。方法：将人球蛋白，

27、注入异种动物，获得抗球蛋白。此种抗体加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，就能出现可见的凝集现象。2011春夏抗球蛋白试验的作用可检测红细胞表面结合的封闭抗体或游离在血清中的封闭抗体，多用于母体Rh（D）抗体检测或自身免疫性溶血性贫血症诊断。2011春夏协同凝集试验原理：金黄色葡萄球菌的细胞壁含有一种特殊的蛋白质（称金黄色葡萄球菌蛋白A，SPA），能与血清中IgG抗体的Fc段非特异性结合，两个保持活性的Fab暴露在菌体（起载体作用）表面，与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。应用：微生物的快速诊断与鉴定，以协助传染病的早期诊断。2011春夏冷凝集试验原理：冷凝集素是红细胞某些抗原的自

28、身抗体，只能在低温时与其相应的抗原结合。冷凝集反应在4时最强烈，红细胞凝集最明显；温度升高后，抗原抗体复合物解离，凝块消失。意义：冷凝集素增高常见于单核细胞增多症和支原体肺炎，恶性淋巴瘤通常伴随冷凝集素慢性增高。2011春夏7.3.3 免疫标记技术免疫标记技术是指用酶、荧光素、同位素等物质标记抗体或抗原进行抗原抗体反应，检测抗原或抗体的技术。具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。根据标记物的不同，免疫标记技术可分为：放射免疫分析酶联免疫吸附试验免疫荧光技术亲和标记的免疫分析2011春夏放射免疫分析（RIA）同位素标记的免疫分析法，常用同位素有125I，131I，3H，35S。方法：液相

29、反应体系用液体闪烁仪计数；固相反应体系用X射线胶片显影。 应用：广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一。2011春夏酶联免疫吸附试验（ELISA）将抗原或抗体吸附在固相（如聚苯乙烯微量板、磁珠等）表面，用酶标抗体或抗原与之反应后，根据固定酶催化底物颜色变化的深浅检测抗原或抗体，此所谓酶联免疫吸附试验（ELISA）。广泛用于食品安全检测、病原体鉴定、生物大分子甄别及药物组分分析等诸多领域。根据检测方法特点和性质的不同可分为： 直接法 间接法 夹心法 竞争法 dot-ELISA ELISPOT2011春夏直接法原理：抗原或抗体固定酶标抗体或抗原与固相反应，洗脱游

30、离的抗原或抗体固定的酶量与受检物量正相关底物酶促反应，产物颜色深浅反映受检物量多少。常用酶类：辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AKP）-半乳糖苷酶（-GAL）2011春夏间接法间接法是检测抗体最常用的方法，利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称间接法。间接法操作流程如下：抗原固定，洗涤；加受检样本，充分反应后洗涤；加酶标抗抗体，充分反应后洗涤； 加底物显色，颜色深度代表样本中受检抗体的量。2011春夏夹心法根据性质不同可分为双抗原夹心法和双抗体夹心法，双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。双抗体夹心法操作步骤如下：抗体固定，洗涤；加受检样本，充分反应后洗涤；加酶标抗体，充分反应后

31、洗涤，此时固定的酶量与样本中受检物的量正相关；加底物，夹心复合物中的酶催化底物成有色产物，据颜色深浅可对受检物定性或定量。2011春夏竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，说明其操作步骤如下：抗体包被，洗涤。待测管中加受检样本与一定量酶标抗原的混合溶液，充分反应后洗涤；参考管中只加酶标抗原，充分反应后洗涤。分别加底物显色，参考管与待测管颜色深度之差，代表受检样本抗原的量，待测管颜色越淡，表示样本中抗原含量越多。2011春夏dot-ELISA在硝酸纤维素膜上进行的酶联免疫吸附试验称为斑点酶联免疫吸附实验（dot-ELISA）。原理：固定抗原或抗体后，洗脱，加酶标抗体或抗原

32、反应，再洗脱。最后的显色反应要用一些特殊的底物，使酶促反应生成不溶于水的有色产物。根据膜上沉淀斑点颜色深浅进行定性和定量分析，使用斑点扫描仪可以进行定量测定。2011春夏ELISPOTELISPOT即酶联免疫斑点试验，其原理与普通ELISA相似，但显色后在细胞分泌特定蛋白的位置显现清晰的斑点，可直接镜检计数，进而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。应用领域：用已知抗原检测分泌特异性抗体的B细胞；用细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子；移植中排斥反应的预测、自身免疫病研究、肿瘤研究、抗原决定簇图谱分析等。2011春夏免疫荧光技术免疫荧光技术是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布

33、的方法。标记已知抗体成荧光抗体，以此为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原。抗原抗体复合物携带荧光素，利用荧光显微镜观察样本，可见荧光所在的细胞或组织，从对抗原进行定性、定位乃至定量检测。常用荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光） 罗丹明（红色荧光）2011春夏亲和标记的免疫分析利用一些特殊蛋白的亲和作用，结合荧光标记或酶标方法可以避免酶标抗体制备的繁琐，广泛应用于免疫分析系统。常用的亲和标记系统有：SPA能与Fc结合，故可用作荧光标记或酶标抗抗体；小分子生物素能与亲和素或链亲和素组成生物素亲和素系统（BAS），结合亲和素或链亲和素的荧光或酶标抗体，可用于抗体芯片系统。2011春夏7.3.4 补体参与的抗原抗体反应原理：抗原抗体复合物可激活补体，活化的补体可以杀伤细胞，据此可用一定量的补体和致敏红细胞来检测抗原抗体间有无特异性结