分子发光分析分解课件

1、第三章 分子发光分析 分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。本章主要讨论荧光分析。3.1 分子荧光和磷光分析一、原理荧光和磷光的产生 室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。下面从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。续每个分子具有一系列严格分立的能级、称为电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动能层和转动能层。示意于右图。图中基态用S0表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用S1、S2表示，第一电子激发

2、三重态和第二电子激发三重态分别用T1，T2表示。0、1、2、3表示基态和激发态的振动能层。 S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫荧光：10-710 -9 s；磷光：10-4 100 s续 电子激发态的多重度用M=2S+1 表示, S 为电子自旋量子数的代数和。其数值为0或1。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。假如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的。即 S=0，分子的多重度 M=1，该分子体系便处于单重态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。分子

3、吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分于处于激发的单重态，如上图中的 Sl 和 S2。如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子使具有两个自旋不配对的电子，即 S=1，分子的多重度M=3，分子处于激发的三重态, 用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定些(洪特规则)，因此三重态能级总是比相应的单重态能级略低，如上图中的T1和T2。 处在激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占优势。有以下几种基本的去活化过程。激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回

4、基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10 -710 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10 -410 s； 第一激发三重态的最低振动能级基态.非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换： 同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换： 激发分子与

5、溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）。S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1。发光速度很慢： 10-4100 s 。光照停止后，可持续一段时间。荧光发射电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0 跃迁），发射波长为 2 的荧光； 10-710-9 s 。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

6、 2 2 1 ；磷光发射二、激发光谱和发射光谱 1. 激发光谱荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可从它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，选择荧光(磷光)的最大发射波长为测量波长。改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光(磷光)化合物的激发光谱。 任何荧光（磷光）化合物都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。他们是定性和定量分析的基本参数和依据。2. 发射光谱简称荧(磷)光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧(磷)光强度，即得到荧(磷)光发射光谱。下图为萘的激发光谱

7、、荧光发射光谱和磷光发射光谱。 stokes 位移。在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去振动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。 3. 激发光谱与发射光谱的关系(1) Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。(2) 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如2)

8、。 (3) 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似. 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱三、溶液的荧光（或磷光）强度1. 荧光强度与溶液浓度的关系发射的荧光光强 If 正比于该系统吸收的激发光的光强，即根据比尔定律：If = I a式中是摩尔吸光系数，l是样品池的光程，c是样品浓度。而式中I a = I0 It= I0 (1-10

9、-lc)If = I0 (1-10-lc) = I0 (1-e-2.3lc)式中I0 是入射光强度，It 是透过光强度。将此式代入上式得当lc0.05 时，可省略第二项后的各项，则续当入射光强与I0与l一定，上式可简写为If = 2.3I0lc即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液的溶液中，当lc0.05 时才成立。对于较浓的溶液，由于淬灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不呈线性关系。If = Kc四、影响荧光强度的因素1.荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备两个条件：（1）分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；（2）吸收了与其本身特征频

10、率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率 () 也称荧光效率或量子效率, 它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示. 分子结构影响荧光强度(a) 跃迁类型(b) 共轭效应(c) 刚性平面结构(d) 取代基效应续(a) 跃迁类型 实验表明，大多数荧光化合物都是由* 或n* 跃迁激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生*或*n跃迁而产生荧光，其中*跃迁的量子效率较高。(b) 共轭效应 含有*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强。这种体系中的电子共轭度越大，电子非定域性越大，越易被激发，荧光也就越易发生，而且荧光光谱将向长波移动。所以绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环；除少

11、数高共轭体系外，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率，并使荧光波长向长波方向移动。续(c) 刚性平面结构 实验发现多数具有刚性平面结构的分子具有强烈的荧光因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小，也就减少了碰撞去活的可能性。 比较荧光素和酚酞的结构。荧光素在溶液中有很强的荧光，而酚酞却没有。这主要是荧光素分子中的氧桥使其具有刚性平面结构。又如芴和联苯在同样条件下其量子效率分别为1利0.18，芴中的亚甲基使分子的刚性增加，导致两者在荧光性质上显著的差别。续(d) 取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化

12、合的的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。一般说来，给电子基团，如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p - 共扼作用, 增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。而吸电子基团，如-COOH、-C=O、 -NO2、-NO、卤素离子等，会减弱甚至会淬灭荧光。如硝基苯为非荧光物质, 而苯酚、苯胺的荧光较苯强。 2.溶剂对荧光强度的影响溶剂的影响可分为一般溶剂效应：指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。有的情况下，增大溶剂的极性，荧光增强，荧光峰红移。8-巯基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四种不同的极性溶剂中的情况就是一例（见下表）。续8-巯基喹啉的荧

13、光峰的位置和荧光效率与溶剂介电常数的关系但也有相反的情况。例如苯氨萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五种醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此，荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，要看各种物质与溶剂的不同而异。例：芘的荧光发射光谱激发波长334nm。芘的荧光发射光谱依次在373 nm、379 nm、384 nm、390 nm 和410 nm 附近出现五重发射峰。其中, 第一发射峰与第三发射峰强度比(I1/I3 )会随着溶液极性的减小而下降。因此, I1/I3常用来表征其所处环境极性的大小, 其值越大表明芘探针所处微环境的极性越大; 反之, 若I1/I3越小则表明

14、芘探针所处微环境的极性越小。芘在水溶液中的荧光谱 (b)在甜菜碱溶液中的荧光谱3. 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响较敏感，因此荧光分析时一定要控制好温度。温度上升使荧光强度下降。主要的原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是溶液温度下降时，介质的粘度增大，荧光物质与溶剂分子碰撞也随之减少。相反，随着温度上升，碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。4. 溶液pH值对荧光强度的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关。因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值。 例

15、Chunxue Yuan, Shohei Saito,Cristopher Camacho, Stephan Irle, Ichiro Hisaki, and Shigehiro Yamaguchi. A -Conjugated System with Flexibility and Rigidity That Shows Environment-Dependent RGB Luminescence. Journal of the American Chemical Society. 2013, 135, 88428845(Received: April 27, 2013. Published

16、: May 30, 2013)Anthraceneimide蒽酰亚胺+cyclooctatetraene环辛四烯Conformational change of with flexible and rigid scaffolds, which perturbs the -conjugation.续环境的影响(a) RGB(red, green and blue) emissions of 1 in PMMA(聚甲基丙烯酸酯) matrix (blue), in CH2Cl2 solution (green), and in the crystalline state (red). Photog

17、raphs under a 365 nm ultraviolet lamp irradiation. (b) The corresponding three luminescence spectra of 1 in the visible region. ex = 350, 350, and 450 nm for blue, green, and red emission spectra, respectively. The same red emission band was observed even when ex = 350 nm.(a) Temperature-dependent f

18、luorescence spectra of 1 in MTHF(2-甲基四氢呋喃) from 163 K (solution) to 77 K (glass). ex = 350 nm. (b) Calculated potential energy diagram for the S0 and S1 states of 1 (see Figure 1) with fixed bent angle . The constrained geometry optimization was performed in the S1 state at the PBE0/def-SV(P) level.

19、温度的影响五、溶液荧光的淬灭 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。荧光淬灭的形式很多，机理也较复杂。Q 淬灭剂3.2 荧光分析仪一、基本结构荧光分析仪基本部件示意图 续(1) 激发光源 在紫外可见区范围，常用的光源是氙灯和高压汞灯。(2) 样 品 池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。(3) 单 色 器 较精密的荧光分光光度计均采用光栅，有两个：第一单色器用于选择激发波长；第二单色器用于分离出荧光发射波长。(4) 检 测 器 荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器具有较高的灵敏

20、度或光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。二、荧光分光光度计 RF-5301PC型适合高灵敏度、高分辨率测定。提供的数据处理、显示功能。测定范围 220750nm及白色光带宽 1.5，3，5，10，15，20nm灵敏度 S/N比150以上（带宽5nm、水拉曼峰时）测定方式 荧光、激励、同期光谱测定、定量测定、时间过程测定日立F-4500仪器光路图四.可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图3.3 分子荧光分析法及其应用1. 定量测定方法 由于自身发射荧光的化合物为数不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质共价或非共价结合形成发荧光的配合物来进行测定

21、。很多无机阳离子的测定都用此法。（i) 校准曲线法 荧光分析一般多采用校准曲线法，即用已知量的标准物质经过和试样一样的处理后，配成一系列标淮溶液，在一定的仪器条件下测定这些溶液的荧光强度，作出校准曲线。然后在同样的仪器条件下，测定试样溶液的荧光强度，从校准曲线上查出它们的浓度。(ii) 比 较 法 如果已知某测定物质的荧光校准曲线的浓度线性范围，取已知量的荧光物质(此量在校准曲线的线性范围之内)配成一标准溶液，测定其荧光强度。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度的比值，求得试样中荧光物质的含量。实例: 稀土离子络合物荧光探针测量胆红素及其荧光猝灭机理研究边

22、玮玮,张娜, 阎芳, 王守训,李耀辉.分析化学.2010,38 :1501 1504摘要在NH4Ac-HAc 缓冲溶液( pH 6.90) 中，强力霉素可以和铕离子( Eu3+) 生成二元络合物，能量从强力霉素转移到Eu3+，发射出Eu3+ 位于612 nm 处的特征荧光。加入胆红素后，强力霉素将能量转移给胆红素。因此，Eu3+ 位于612 nm 处的特征荧光强度降低，且降低的荧光强度与加入胆红素的浓度成正比，据此建立了荧光光度法测量胆红素的方法。在最佳实验条件下，测量的线性范围为5.0 10 - 8 3.0 10 - 5mol /L; 检出限为8.4 10- 9mol /L。本方法操作简单，

23、可以较好地避免共存物质的干扰，并成功用于人血清样品中胆红素含量的测定。测量原理本实验选择强力霉素作为Eu3+ 的配体，所形成的二元络合物能够发射出Eu3+ 位于612 nm 的特征荧光。实验表明，加入胆红素能够显著降低Eu3+位于612 nm 处的特征峰，并且荧光强度的降低值与加入的胆红素的浓度成正比，据此建立了测量人血清中胆红素的荧光分析方法。本方法可以在室温下操作。应用本方法测量人血清实际样品中胆红素含量，并讨论了体系荧光猝灭的机理。胆红素强力霉素2 实验部分2 1 仪器与试剂RF-540 型荧光分光光度计、UV-265 型紫外-可见分光光度计( 日本岛津公司) ; PHS-3B 型酸度计

24、( 上海雷磁仪器厂) 。胆红素( BR，上海卫辉化学试剂厂) 储备液: 准确称取适量BR，以石英亚沸蒸馏水溶解，使用前以石英亚沸蒸馏水稀释得工作液( 1.0 10-5 mol /L) ; 强力霉素( DC，中国药品生物制品检定所) 储备液: 准确称取0.1918 g 强力霉素，以石英亚沸蒸馏水溶解并定容至500 mL，得6.0 10-3 mol /L 的储备液，使用时以石英亚沸蒸馏水稀释得工作液( 6.0 10-4mol /L) ; Eu3+ 储备液: 准确称取适量Eu2O3( 99. 99%，上海跃龙有色金属有限公司) ，加入少量浓HCl，加热使其溶解，并挥发至近干，然后用0 1 mol /

25、L HCl 稀释至100 mL，作为储备液，使用时以石英亚沸蒸馏水逐级稀释至5. 0 10 -4mol /L; 0.10 mol /L NH4Ac-HAc( pH 6. 90) 缓冲溶液。以上储备液与工作液均需置于0 4 的生化培养箱内保存。2. 2 实验方法2. 2. 1 绘制标准曲线 在10 mL 比色管中依次加入2 0 mL 0 10 mol /L NH4Ac-HAc 缓冲液( pH 6. 90) 、1. 0 mL 5. 0 10-4 mol /L Eu3+ 溶液、0.5 mL 6.0 10-5 mol /L DC(强力霉素) 溶液和2.0 mL 1. 0 10-5 mol /L BR

26、溶液，以石英亚沸蒸馏水定容至刻度，在室温放置20 min 后测量吸收光谱和荧光光谱。在ex /em =385 /612 nm 处，测定其荧光强度F，同时测定其试剂空白( 缓冲液-DC-Eu3+) 的荧光强度F0，加入BR 后使Eu3+-DC 体系荧光强度的减小值表示为F = F0 - F。利用标准曲线法进行人血清中痕量胆红素的含量测定。2.2.2 人血清样品的处理方法 按文献3对血清进行预处理: 取血清1.0 mL，加入乙腈2 mL，搅拌，以4000 r /min 离心20 min，取上层清液至分液漏斗中，加入氯仿4 mL，用HCl 调至pH 1 2，振荡，静置，取下层溶液于另一分液漏斗中，用

27、NaOH 调至pH 12 13，振荡，静置，取上层清液，加0.1 mol /L NH4Ac-HAc 缓冲溶液( pH 6.90) 2 mL，用HCl 调至pH 6 7，定容至10.0 mL，待测。3 结果与讨论3.1 荧光光谱和吸收光谱DC-Eu3+ 以及加入不同体积BR 的DC-Eu3+-BR 体系的荧光光谱见图1。由图1 可见， DC-Eu3+ ( 曲线1) 在590和612 nm 出现两个Eu3+的特征峰，分别对应于Eu3+ 的5D07F1和5D07F2跃迁，这表明能量从配体DC 有效地转移到了Eu3+。DC-Eu3+-BR 的荧光光谱( 曲线2 4) 和DC-Eu3+的荧光光谱形状相似

28、，但在DC-Eu3+-BR 体系中，加入不同量的BR，Eu3+在612 nm 的特征荧光强度发生规律性降低。图1 DC-Eu3+ 体系以及加入不同体积BR 的DC-Eu3+ -BR 体系的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of different mixture1. Doxycycline(DC)-Eu3+; 2. Eu3+-DC-Bilirubin(BR) ( BR: 0.5 mL ) ; 3. Eu3+-DC-BR ( BR:1.0 mL) ; 4. Eu3+-DC-BR (BR: 1.5 mL)3.2 酸度的影响 酸度对体系的荧光强度有很大的影响(见图3)。由

29、图3可见，在pH 6.0 8.0 之间，体系的F 先增大后降低。当pH = 6.8 7.0 时，体系的F 值达到最大且基本保持不变，故本研究选择pH 6.90 的0.1 mol /L NH4Ac-HAc 为缓冲体系。同时考察了缓冲溶液用量的影响，当缓冲溶液加入量在1.5 2.5 mL 时，F 基本保持稳定且荧光强度最大，故本研究中缓冲溶液加入量选择为2. 0 mL。3. 3 Eu3+ 浓度与强力霉素浓度比值的影响3.6 线性范围和检出限3.7 血清中BR 的测定3. 4 反应时间和加入顺序的影响3.5 共存物质的影响在最佳实验条件下，考察了人体中常见的金属离子和氨基酸类等共存物质对检测2 0

30、10 - 5mol /L胆红素的影响。在相对误差在 5%范围内时，Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Zn2+、鸟嘌呤、腺嘌呤、L-组氨酸、L-胱氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、蛋氨酸等物质不影响测定。测定结果荧光分析法的特点灵敏度高 与紫外可见分光光度法比较，荧光是从人射光的直角方向检测，即在黑背景下检测荧光的发射。所以一般来说，荧光分析的灵敏度要比紫外可见分光光度法高24个数量级，它的测定下限在0.10.001ug.cm-3之间。 选择性强 荧光法既能依据特征发射，又能依据特征吸收来鉴定物质。假如某几个物质的发射光谱相似，可以从激发光谱的差异把它们区分开来；而如果它们的吸收光谱相同，则可用发射光谱将其区分。 试样量少和方法简便。 提供比较多的物理参数 荧光分析法能提供包括激发光谱和发射光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等许多物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供被研究的分子的信息。某些有机物的荧光测定氨基酸和他们的荧光特性 氨基酸方法激发波长(nm)发射波长(nm)灵敏度(ug/mL)色氨酸直接测定pH112873480.003酪氨酸直接测定pH72803100.01苯丙氨酸直接测定H2O260282