《饲料中志贺氏菌活菌的检测 emapcr法》河南省地方标准

1、饲料中志贺氏菌活菌的检测 EMAPCR法河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义志贺氏菌（Shigella）又称痢疾杆菌，属于革兰氏阴性菌，是一类具有高度传染性和严重危害性的食源性致病菌，能导致人类及仔猪、鸡、奶牛等多种动物的结肠粘膜性炎症，主要表现出恶心、呕吐、腹泻等症状，严重危害人和动物的健康。有调查显示，全球每年有1.6亿人患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下的儿童。2003年10月31日宁波市某幼儿园发生了一起集体食物中毒，共有48人发生了不同程度的高热、腹泻、腹痛、恶心、呕吐等中毒症状，发病率为36.9%，经流行病学调查、临床分析和实验室证实为由志贺氏菌引起的。志贺氏菌随患

2、者粪便排出，污染水源、环境等，或通过苍蝇、蟑螂、鼠类等间接传播。微生物污染饲料是人畜传染病传播的重要途径，饲料作为畜禽的“食物”，其质量的优劣直接影响到畜禽养殖业的经济效益及畜产品的质量安全，因此饲料的安全至关重要。目前饲料中志贺氏菌的检测一直以来是质检机构检验能力上相对较为薄弱的环节，大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法，步骤繁琐，检验周期长，且容易漏检，远不能满足应对突发公共卫生事件上及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高的要求，因此，建立一种快速、准确的检验手段非常必要。本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（Invasion plasmid antigen H, ipaH）为靶基因设计一对特

3、异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分志贺氏菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测志贺氏菌的灵敏度在1.2102 cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要12 h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中志贺氏菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知（豫质监标发2

4、017104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准饲料中志贺氏菌活菌的检测EMA-PCR法（立项编号：20171210484）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：GB/T 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法， GB 19489 实验室生物安全通用要求，GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：志贺氏菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1. 引物设计 参考已发表的文献，从

5、GeneBank下载志贺氏菌的ipaH基因序列。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增386 bp大小的特异性引物对。表1 引物序列引物序列片段大小上游5-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA -3386bp下游5-CCAGAGGGAGAACCAGTCCTTA -32. EMA-PCR方法参数的优化 首先是探索志贺氏菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度

6、。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。3. 确定方法的灵敏度和特异性。4. 用建立的志贺氏菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与GB/T 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法进行对比，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：志贺氏菌EMA-PCR检测方法应用实验 本阶段主要进行志贺氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南

7、省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批沙志贺氏菌阳性样品，并对志贺氏菌进行了分离鉴定。同时与GB/T 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB/T 13091完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间；通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定 根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了饲料中志贺氏菌活菌的检测 EMA-PCR法河南省地方标准草案，规定了适用范围、样品处理方法、

8、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的饲料中志贺氏菌活菌的检测 EMA-PCR法（草案）。项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：吴志明：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和技术推广。方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责此标准校订及推广。董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和推广。李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的校订。狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的校订。四、内容说明1. 检测方法

9、基本原理EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组DNA发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的DNA不能作为模板进行PCR扩增。根据志贺氏菌ipaH基因设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行PCR扩增、凝胶电泳分析，含志贺氏菌活菌的样品会在386 bp处出现一条目的条带，而含有志贺氏菌死菌DNA及非志贺氏菌的样品不会出现该条带。2. 最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5 麦氏单位 （MCF）志贺氏菌菌悬液中分别加入EMA，使其终浓度分别为0、0.5、1、2、4、8 g/mL，PCR结果电泳图分别为图1，图2，图3。由图可以看出

10、煮沸法致死效果最理想，加入EMA终浓度为0.5 g/mL既能完全抑制0.5 MCF志贺氏菌死菌的扩增。另向0.5 MCF活菌菌悬液加入EMA，使其终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 g/mL，PCR电泳结果如图4。由图4可以看出加入终浓度为4 g/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱，表明终浓度4 g/mL的EMA添加量不会抑制志贺氏菌活菌的扩增。图1煮沸处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA； 3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2g/mL EMA；6：4g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图2

11、 紫外照射处理注：M：Marker；1：阴性对照；2：0 g/mL EMA；3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2g/mL EMA；6：4g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图3 异丙醇处理图3 异丙醇处理注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：0.5 g/mL EMA；4：1 g/mL EMA； 5：2g/mL EMA；6：4g/mL EMA； 7：8 g/mL EMA图4 EMA浓度对志贺氏菌活菌PCR的影响注：M：Marker；1：阴性对照； 2：0 g/mL EMA；3：0.2 g/mL EMA；4：0.5 g/mL EMA

12、； 5：1 g/mL EMA；6：2 g/mL EMA； 7：4 g/mL EMA；8：8 g/mL EMA； 9：16 g/mL EMA；10：32 g/mL EMA 将煮沸致死0.5 MCF的志贺氏菌菌悬液，加入EMA终浓度为0.5 g/mL，黑暗环境下孵育5 min后，分别曝光0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 min，处理后PCR产物电泳结果如图5所示。由图5可以看出只有不曝光的的有条带，其他均无条带，说明EMA处理后，曝光1 min，即可使EMA与死菌充分交联。图5 曝光时间注：M：Marker；1：0 min； 2：1 min； 3：2 min；4：4 min； 5：6 mi

13、n； 6：8 min； 7：10 min； 8：阴性对照3. PCR方法的敏感性用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的志贺氏菌菌落转接于5 mL灭菌去离子水中，用比浊仪调至0.5 MCF，系列稀释至10-1-108，以此为模板，按上述方法进行EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3个重复，37培养24 h，检测PCR反应灵敏度。结果表明，建立的PCR方法检测限是1.2102 cfu/mL（图6）。图6 PCR敏感性检测注：M：Marker；1：阴性对照； 2：108 CFU； 3：107CFU；4：106 CFU； 5：105 CFU； 6：104 CFU；

14、 7：103 CFU； 8：102 CFU；9：10 CFU；10：1 CFU4. PCR方法的特异性将志贺氏菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于LB肉汤中过夜培养，取菌液作为PCR反应模板，按上述方法进行试验。结果如图7，由图可以看出以志贺氏菌标准菌株、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌及鲍氏志贺氏菌为模板的PCR产物均出现有1条特异性的386 bp 条带，与预测序列片段大小相符；而阴性对照、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等12株非志贺氏菌菌株未出现任何扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的PCR方法具有很高的特异性。图7 PCR特异性检测注：M：Marker； 1：志贺氏菌 ATCC12022；2：阴性对照；3：痢疾志贺氏菌；4：福氏志贺氏菌； 5：鲍氏志贺氏菌； 6：沙门氏菌；7：甲型副伤寒沙门氏菌；8：福鼠伤寒沙门氏菌；9：猪霍乱沙门氏菌；10：阪崎肠杆菌；11：金黄色葡萄球菌；12：大肠杆菌；13：单增李斯特氏菌；14：肠致病性大肠杆菌；15：肠产毒性大肠杆菌；16：肠侵袭性大肠杆菌；17：肠黏附性大肠杆菌5结果报告凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在386 bp处出现一条目的条带（见图8），即可报告该样品中检出志贺氏菌。图 8 志贺氏菌活菌的EMA-PCR检测