医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测

1、安徽省细菌耐药监控中心1一、医院感染1、定义 医院感染(nosocomial infection)是指患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。随着医疗技术发展，各种侵入性操作和器官移植推广，化疗、糖皮质激素、抗生素等广泛应用，医院感染是当今医学领域中的重要问题。22、病原学 细菌为最常见的病原体，细菌的种类与分布因感染类型、医院类别、患者基础疾病和治疗措施不同各异。目前，以革兰阴性杆菌为主(如肠杆菌科和非发酵菌)，近十余年来抗生素大量应用，常见耐甲氧西林葡萄球菌医院感染，留置导尿、人工心脏瓣膜等的医院感染中凝固酶阴性葡萄球菌感染率上升，手

2、术切口和尿路肠球菌感染也不少见。厌氧菌和深部真菌作为机体正常菌群常引起内源性感染，如腹腔、盆腔感染、菌血症等。33、感染源 引起医院感染的病原体来源于住院病人、医务人员、探视者、陪护人员，来自于医院环境及未彻底消毒灭菌的医疗器械、血液制品的污染菌等，大多为条件性致病菌，且有程度不同的耐药性。4、易感人群 免疫力低下状态的住院患者成为感染的易感人群，同时住院期间接受不同种类药物治疗和某些治疗措施为病原体感染创造了入侵和繁殖条件。 4二、医院感染病原体的确定 1、感染菌的鉴定： 引起医院感染的致病菌的鉴定比一般的致病菌的鉴定要求要高，实验室必须鉴定到种的水平。细菌鉴定依据表型生化反应，八进制的编码

3、鉴定法，必要时辅助血清学鉴定。 52、药敏试验的鉴定： 药敏试验的方法有K-B法、微量液体稀释法和E-test法，药敏试验的结果除了能提示用于控制感染的药物外，还提供感染菌的耐药谱，根据来自同一感染源的感染菌具有相同耐药谱的特征，作出医院内感染的判断。 63、耐药表型的检测： 医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些细菌的耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素的肠球菌（VRE）。 74、医院内感染的分子生物学检测 ：（1）多位点酶电泳（multi locus enzyme

4、 electrophoresis, MLEE） 将菌株培养物破碎，离心取上清液，在淀粉胶上进行电泳，电泳完成后将胶切成小条，分别与不同的酶底物作用进行酶染色，不同的酶分子在不同的电泳位置显影，组成了菌株的电泳型。当酶分子的基因发生一个或多个位点变异时，电泳迁移率相应发生变化。 8（2）限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 将菌株培养物破碎，提取DNA，以限制性内切酶进行切割后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后作溴乙啶染色，通过分析电泳区带图谱对菌株进行鉴别；可以将电泳分离的核酸片段转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用

5、标记的探针与之杂交，用于菌株的鉴别。 9（3）多态DNA的随机放大(random amplification of polymorphic DNA,RAPD) 多态DNA的随机放大又称随机引物PCR，在菌株的DNA提取物中加入约10个碱基的随机引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物进行电泳和溴乙啶染色，分析染色图谱可用于菌株的鉴别。 10（4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE） 将菌体包埋于琼脂中，先后用酶破坏细胞壁和分解蛋白质，以切点较少的内切酶剪切细菌的DNA，以随时变更电场方向的电泳装置对大片段DNA进行电泳，根据电泳图谱对菌株

6、进行识别。 1112（5）放大片段长度的多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 对菌株的DNA进行限制性酶切，然后用特定的引物从限制性片段中将相应的片段选出，经PCR扩增后再进行电泳分析。（6）核酸序列分析(nucleotide sequence analysis) 用PCR的方法将菌株DNA的某一片段进行扩增放大，然后进行测序，对各分离菌株的序列进行比较。 13三、药敏试验 药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映，实验室所报告的药敏试验结果，临床根本或很少使用这类药物，实验室药敏试验中药物是敏感，临床使用无效。如何联合用药、合

7、理用药？实验室人员应根据可能的细菌种类、细菌的菌属，合理选用药敏纸片，报告检验结果。实验室应根据美国FDA推荐临床微生物实验室苛养菌和非苛养菌分组的药物选用，它将药物分为四组：A组，一级试验并常规报告的抗生素 ；B组，一级有选择报告的抗生素 ；C组，补充试验，有选择报告的抗生素 ；U组，用于泌尿道补充试验的药物。14例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素；选择报告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛、头孢吡肟、头孢美唑、头孢哌酮、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲

8、松、环丙沙星或左氧氟沙星、亚胺培南或美罗培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。15 对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶、庆大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，选择报告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、头孢哌酮、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素。16对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或红霉素、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、万古霉素。对于肠球菌常规报告的抗生素有青霉素/氨苄西林 ，选择报告的抗生素有万古霉素 。17对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有头

9、孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟或头孢曲松、头孢呋辛钠（针剂）、氯霉素、美罗培南。18对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四环素、万古霉素。19对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林，选择报告的抗生素有氯霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟或头孢他啶或头孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/达福普汀。20对于淋球菌常规报告-内酰胺酶结果，如-内酰胺酶阳性提示青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药，但淋球菌更多的是染色体介导的耐药，需要做补充药敏试验

10、，选择报告的抗生素有头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢唑肟或头孢曲松、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢呋辛、环丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大观霉素、四环素。21遵循严格的操作方法、施加质量控制：纸片扩散法（K-B）法、液体稀释法必须遵循NCCLS规定，它对纸片厚度、药物浓度、培养基、培养环境、孵育温度、操作方法都有详细规定。E-test必须按照其说明要求进行。22运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试氨苄西林、一种喹诺酮类药物和TMP/SMZ药物，1、2代头孢菌素尽管体外敏感，但临床治疗无效，实验室不能做此药敏试验。对于肠道外分离株，沙门氏菌属还

11、一定要测试并报告氯霉素和某一种三代头孢菌素。对于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐庆大霉素肠球菌、AmpC- -内酰胺酶应有所选择性报告药敏结果，有时体外药敏结果是敏感的也要报告耐药。231.药敏试验种类和方法：（1）细菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法（2）酵母样真菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法浅部真菌目前尚没有标准方法。24细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-Bauer agar disk diffusionPaper disk containing antibiotic is placed on lawn of bacteria, then incubate

12、d overnight. Diameter of zone of inhibition is inversely related to MIC (used to establish interpretive breakpoints).Standardized for commonly isolated, rapidly growing organisms.2526细菌药敏试验-液体稀释法Minimal inhibitory concentration (MIC)Reference method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic.

13、 Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by agar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels 104 cfu420mg/ml27细菌药敏试验- E-test法E-testStrips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and i

14、ncubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip.Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.28四、细菌耐药机制的检测1.甲氧西林葡萄球菌的检测：MRSA(Methicillin-resistant Staphylococus aureus) 、MRSCON（Methicillin-resistant coagulatase-negati

15、ve Staphylococcal species）检验：29（1）纸片扩散（K-B）法由于苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1 g/片，3524小时孵育，抑菌圈直径10mm。2004年NCCLS推荐耐甲氧西林葡萄球菌评判标准:采用头孢西丁纸片（30 g）, 孵育24小时,对于金黄色葡萄球菌抑菌圈19mm为MRSA，20mm为MSSA;对于凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈24mm为MRSCON，25mm为MSSCON. 3031(2).琼脂稀释法筛选试验：苯唑青霉素耐药培养基：含NaCL的M-

16、H琼脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6g /ml苯唑青霉素或10 g/ml甲氧西林接种：直接菌落悬液约0.5麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。培养条件：35空气培养时间：24小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48小时后再检测最可靠。结果：1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药32目前治疗方案：MRS轻度感染 ：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌称之为VRSA Vancomycin-risistant S.aureus 只能

17、用链阳霉素治疗。目前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉素基因转移到金黄色葡萄球菌中已获得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8 g/ml），且国际上尚未承认；2002年6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC 16 g/ml,对万古霉素MIC128 g/ml的耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。332.肠球菌的检测：肠球菌是一种重要的病原微生物，实验室应做高耐庆大霉素肠球菌的检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁的药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。 有条件的实验室还应作Van A,Van

18、 B,Van C耐药基因监测。治疗原则：Van A：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐-青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐-青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。Van B：氨基糖苷类非高耐株-壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株-壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药的肠球菌目前尚无有效的治疗方案。3435（2）肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验 庆大霉素HLAR抗生素含量： 500ug/ml接种： 液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。 孵育条件 35空气孵育时间 24小时结果：琼脂：1

19、菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、 青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药36筛选试验 链霉素HLAR抗生素含量： 肉汤1000ug/ml 、 琼脂2000ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。 液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。 琼脂-10ul0.5麦氏 比浊管悬液点种在琼脂表面。 孵育条件： 35空气孵育时间：24-48小时（如孵育24小时为敏感时，需继续孵育）结果：琼脂：1菌落=耐药；肉汤：任何生长

20、=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、 青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药37筛选试验： 万古霉素耐药抗生素含量： 6ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。 液体生长法或直接菌落法至 0.5麦氏比浊管。1-10ul0.5麦氏 比浊管悬液点种在琼脂表面。 孵育条件 ：35空气孵育时间 ：24小时结果： 1菌落=耐药 进行万古霉 素MIC测定 和动力试验产生的色素来区别获得性耐药 （VanA,VanB） 和那些对万古霉素天然的中 水平耐药（Va

21、nC） 如敦鸡肠球菌、铅 肠球菌和黄肠球菌， 它们通常在万古霉素 筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药383.超广谱 内酰胺酶检测： 超广谱-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导的对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感的，是-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。 ESBLs编码基因在质粒上，易在不同菌株间播散，表现为多重耐药。目前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被-

22、内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。 39治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2. -内酰胺类/酶抑制剂,3.氨基糖苷类抗生素如阿米卡星，4.头霉烯抗生素如头孢西丁。在超广谱-内酰胺酶 检测条件不具备的地方，临床可以通过实验室报告的作推测治疗，若药敏报告提示三代头孢例如头孢泼肟、头孢他啶、氨曲南、 头孢噻肟、头孢曲松有二者以上耐药极有可能是产超广谱-内酰胺酶 。40(1)纸片初筛：培养基： Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度: 头孢泼肟 10ug 或 头孢他啶30 ug 或氨曲南 30 ug 或头孢噻肟 30 ug 或头孢曲松 30 ug （使用两个以上纸片做筛选试验可提高

23、检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件： 35大气环境孵育时间： 16-18小时结果： 头孢泊肟抑菌环 22mm， 头孢他啶抑菌环22mm，氨曲南抑菌环 27mm，头孢噻肟抑菌环27mm，头孢曲松抑菌环 25mm，=可能产生ESBL。建议质控方法: 大肠埃希菌ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准） 肺炎克雷伯菌 ATCC700603:头孢泼肟抑菌环 9-16mm,头孢他啶抑菌环 10-18mm,氨曲南抑菌环 9-17mm,头孢噻肟抑菌环 17-25mm,头孢 曲松抑菌环 16-24mm。41纸片确证试验：培养基： Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度： 头孢噻肟 30 ug 、

24、 头孢噻肟/棒酸 30 ug/10 ug和头孢他啶30 ug 、 头孢他啶/棒酸 30 ug/10 ug（确证试验须使用头孢 噻肟、头孢他啶及两者与棒酸的混合纸片）接种： 按标准纸片扩散法孵育条件 ： 35大气环境孵育时间 ： 16-18小时 结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5 mm 以上=ESBL建议质控方法：大肠埃希菌ATCC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌 ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5 mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢

25、噻肟单独药物纸片抑菌环直径 增大3 mm以上。4243液体稀释法初筛:培养基： CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟 4ug/ml 或 头孢他啶1 ug/ml 或氨曲南 1 ug/ml 或头孢噻肟 1 ug/ml 或头孢曲松1 ug/ml （使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）接种： 按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件：35；空气孵育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS的产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松 MIC2 ug/ml；头孢泼肟MIC8 ug/ml ）质控建议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，

26、头孢泼肟MIC8 ug/ml44液体稀释法确证: 培养基:CAMHB药物浓度:头孢他啶0.25-128ug/ml, 头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4ug/ml和头孢噻肟0.25-64ug/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4ug/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。接种:按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件:35空气孵育时间:16-20小时结果判读:对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后，MIC与不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为ESBLs（如头孢他啶的MIC=8 ug/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1 ug

27、/ml）。质控建议:肺炎克雷伯菌ATCC700603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比，应当降低3个以上对倍稀释度。452005年NCCLS新增奇异变形杆菌的ESBL 试验药物纸片筛选 (mm)MIC 筛选 (g/ml)大肠/肺克MIC 筛选 (g/ml)奇异变形头孢泊肟10g 1782*头孢他啶30 g 2222氨曲南不用2不用头孢噻肟30 g 2722头孢曲松不用2不用*只用于奇异变形杆菌 (大肠杆菌和肺克是 8 g/ml ) 46用标准ESBL表型确证试验 ,无改变Routine screening not recommendedPerform ESBL test when clinically relevant (e.g., bacteremia) Consult with medical staff to determine when to testPractical approach, test sterile body site isolatesUse standa