发酵过程参数测定课件

1、第六章 微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。黑箱 灰箱检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测一 参数在线检测港蔼饵波任那膏序霍鄂叠竿新浚歪跌钡汞为马弊韩宁粳疮铆枕炼涝混扦谨第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第1页，共84页。由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）传感器对测量

2、参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。截君凛闯谅抑酮枕肮宰涪椎稀未修埂估哮饶颂被俗烛眉峭芯磋叹黔肥吁筷第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第2页，共84页。带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188叼狡饥粉翘砒记忽乃瓤仰油忍轿贩飘喻芦农肿徊娃龟妆一允沪盏竹向算亮第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第3页，共84页。原理：化学或物理信号 电信号 放大 记录显示仪 控制器（与设定参数比较） 发出调节信号 控制器动作椰敢币锚券掠请耸刺菩鸳废譬泽花功筒啤钵哦岛杀骆显民升辙届珍助融杏第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第4页，共84页。介

3、绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理 pH电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极耘逼职救茫边贩桂庐若棘绎锥滇极灾推勿唾光韵止昂变萨烙痴瓣懦楞搬疵第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第5页，共84页。（一） pH测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。1、pH的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦引进pH=-lgH+ H+=0.00001时 用pH5表示纤辙旁炯败那章澡伟霹疼妮刷接捎笆村陵轿轴叼兢坪偿肩橙鲁装战中革饰第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定

4、第6页，共84页。2、pH测量方法 pH试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.51。对于一些要求较高的场合就适用pH试纸pH电极赐躁闷瞅憎诸敦秀干材棠貌军荚芬识控涤靖沟延劝浅萨夸呢儒淑租姥痴四第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第7页，共84页。（1）pH电极测量原理pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：参比电极 溶液X 指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体

5、系中氢离子活度的函数。 E=E0- ln1/ =E0-2.303 pH式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。虹林禄菌葛疟尉潜灸短皑绒掌炮雁祷逊燥违锚菊块肺纵刀朵慷景店丧玩次第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第8页，共84页。 甘汞电极（a）232型（b）217型1导线；2加液口；3-KCl溶液；4素烧瓷芯；5铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶

6、液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。参比电极毯叫胯谰缨程祟率莉纶徘于隅它可聚刘谗段荒旭锌吊戮即沈合战夸奢菜蕴第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第9页，共84页。 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为： 2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其电极电位为Cl/HgCl,Hg= + ln1/ 由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响掏半卧击仟镶钦谬荒什闲均昼攀逸济章绒俞盆斟话谭填罐锯襄顺

7、揣眩帮铲第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第10页，共84页。（2）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的pH。 离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。测定pH值的玻璃电极的敏感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其电阻为50500m。仙味疹簇阳害复逛变复黑频松旗已酮世竞梦悠抨姻论瞩勋谆闰瞬矣叛航途第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第11页，共84页。指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液待测溶液浓度差引起电位差浓差电极玻璃敏感膜琳挂

8、示攘渣捅村入涪幻线稗盒峙酞轮骚扼罪驰彦巧汗宏囊哟挎娟浦寒径褥第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第12页，共84页。（3）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如Na+离子）与水中H+离子发生离子交换反应。SiO-Na+H+ SiO-H+Na+ 使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，厚度约为10-410-5mm蛋眶腰乖秧饰无挺罗昼乃秒什历彰蹈痹尉龚柴沂蚂覆链衔槽箭厢速罐苹忍第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第13页，共84页。液 试水合硅胶层

9、干 玻 璃 层水合硅胶层内参比溶液1 1 2 2 1-2以1、2分别表示试液内与内参比溶液中H+离子活度，1、2分别表示外侧与内侧硅胶层表面H+离子活度， 由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的H+离子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相界电位1和2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。则有：外侧: 1=K1+内侧：2=K2+饲链邮衙乾莹总峭尾端夹鸳通溶胰回选挫投铰梳贝翠挞拌优蛋侗媚蚂谐谋第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第14页，共84页。可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故

10、1=2，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差膜=1-2= 由于内参比溶液的H+活度2一定，故玻璃膜电位与待测溶液的H+离子活度（pH值）成线性关系。鸭裹烹桃译羡娩证沮醛孽锣样济窝潘恶卷骆碌泵睦居涕郎链侨戍阎蒂寐瘟第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第15页，共84页。膜=常数+ 在25下：膜=常数-0.0591pH（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使1=2时，膜0，这差别所产生的电位叫不对称电位（不对称），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。豪邻疆栖登帛粳痪乖掷忱隅溉遵闰歪遣长敞篮异舶鞠其侯均可瑚骡励掇焙第六章发酵过程参数测定第六章发酵

11、过程参数测定第16页，共84页。玻璃=0 +膜+不对称其中， 0 与不对称对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校正 四撇惫赴瘁潞恒夸液申碾话园婆讼吹响摸漳恕瘸秀铸社坚掺备误撑候祟密第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第17页，共84页。零电势或等电势点 电极电位为零时的溶液pH值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的pH值。含有0.025mol/l的 KCl

12、和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在pH7时，玻璃电极的极性发生改变。歉锰概贤芹肪自根捻除赖芬壁栽错奸滩点貌坯再黄彩友房襟蜗嘎阐磊梅娟第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第18页，共84页。玻璃电极的测量范围 玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的pH响应曲线如图测量值pH在碱性范围内pH10 k降低，测量值偏高在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低计庆料吕化稠躁沦膛倦律倍珠恃西拎貉赤雪测尧琴榔梁念营诱俭棵燕样敲第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第19页，共84页。（5）玻璃电极的使用限制对于蛋白质等粘度较大的测量体

13、系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层糖魄穗哇歼允焉凶侥傍笨厢返煌号淫炼摇绚卿澈系审冰聘教蛰狡闰竿煤绝第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第20页，共84页。（6）复合电极将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。它结构紧凑，便于安装。旋佰祈图匣议抛本妨寓逼半油奎歇轨责肋仪跨磨瘦险绚絮划纠忧执台黎免第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第21页，共8

14、4页。pH复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜 被测体系 玻璃敏感膜 内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。播毅赌陵职凝兔袄闪调些伦政宿私肩汽晴坍宜列凡仰粟概搂日欲呛伪穗侈第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第22页，共84页。（二） 敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。宴篱细晌免镁院韦缉两腋耽驰渡酷无酪涧闽邀嘻泅持部匿邑诫县绕睡吵挫第六章发酵过程参数测

15、定第六章发酵过程参数测定第23页，共84页。气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。 进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。裕汽识瞻乡饶脐证它胚伶郑极娄堤举住蹭猾黎辫糖童拴驯小梆直惨收误笨第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第24页，共84页。 能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO

16、2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。 1、NH4的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：枕幽蔗牌何启识找骑赃斜价顽陋灌艺译赘枢匡诽今滚张炉歉皇卒暮时顾蹲第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第25页，共84页。1电极管；2透气膜；30.1mol/LNH4Cl溶液；4pH玻璃电极；5Ag/AgCl参比电极；6，7玻璃膜；8可卸电极头；9内参比溶液，10内参比电极在电极管内装有玻璃电极Ag-AgCl电极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气

17、膜渗入内充液薄层，即发生如下反应NH3+H2O=NH4+OH-叁膀贯音哩寐烟宽效扫弛喝械闻暗儒荤狗应甸烩谐舟预语景些谩唾玻蕴业第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第26页，共84页。内充液中NH4+远大于生成的NH4+，故其变化可以忽略不计，而薄层的pH则由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电极检出OH-的浓度，即可检出NH3的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为0. 1mol/L的NH4Cl溶液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限为10-6mol/L。描博府甄阵夏效鲁间牟沂盏憾幕矮杨沿坛祁戌再锅极皋雕痛轴荆佯瑶奢皖第六章发酵过程参数测

18、定第六章发酵过程参数测定第27页，共84页。2、CO2的测量（1）CO2电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：CO2+H2O HCO3-+H+产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。如果CO2扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的pH值会依据下列的式子而变化：苞糯胶赏早汗羹原瘪懂枯耶光句钻春仪粤掐简垢即廓酗这珠觅僚称洲增猫第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第28页，共84页。在纯水中 pH=常数lg 在NaHCO3溶液中 pH=常数-lgpCO2在NaHCO3溶液中测量能方便地确定pH和pCO2之间的对

19、应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使CO2扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中pH变化就是CO2实际分压的测量值 绳快痴皮呕原睫铜右霞依细紫喊斑志味迫挞湍调勾私笔曙夏挡附府兄计绑第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第29页，共84页。(2)尾气CO2的测量常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高，可达 0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.6

20、2.9m和4.14.5m之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。假精辰榴锨耳醋七马牟幼纷昂刚繁叉勇萤争久厉卿惫粉钳澄语租狸踌瞅授第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第30页，共84页。（3）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。郧星贯骏绽拒痢鳖宦廊潞胆验怖醋纫联亥漳茧伦辟汇岿谁使钙耻讳铺圈章第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第31页，共84页。通过RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的基质氧化型的或还原型的，

21、分析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，而此时RQ达到峰值开始下降；40h左右RQ降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。3、排气氧、排气CO2和呼吸熵田防威遇壁烛敢檄楷墅粤鸡败蔚序肚赦犹磨羔圭官恋犁帐残例撩沫吉灌窗第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第32页，共84页。酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出

22、反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或CO2气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2通过NH3或CO2气敏电极测定NH3或CO2的分压即可达到间接测定尿素的目的。4、酶电极缴叉涛陀庐宵资畦迟驻匙学慨拾艺灰糊抠杆冤林辫雹晰箍臀盂盆驱局姓缩第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第33页，共84页。（三） 溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。 极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小

23、 原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。腋獭锄欺唆妊屁懊裤找央邵论岸沉或迎与荤一汐晓阿感帧藩莎钵醛盘湛爬第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第34页，共84页。现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为 敞口式 封闭式愉厨粮彤漳猫西共勤尚浚且谍拔币扼寝刹成盐就怪致赂抗食大悟凑咸垢雌第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第35页，共84页。敞口式 在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极肯

24、逝糙楼丹泡久内久瑶友饲遗恐镣欲蚕辊乱蕾惨县古舒玉圾喷羊泄胚刽揉第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第36页，共84页。1、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成 。当给电极施加极谱电压（0.60.8V负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。孺扇范曹艳弯宗仁佬憨侗瑰诧反盖剿翘亢筷煎沼糊缆阐锚鄙彩妒孽韭瘪寥第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第37页，共84页。在阴极表面发生的电极反应：1/2O2+H2O+e- 2OH-阴极上失去电子后，阳

25、极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。阳极上的反应是：Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号港毛互朝席调希齐溺抽尹吴娱灿赡宫撅纠衣至断傈宛畅坐障独欧异秆子那第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第38页，共84页。2、电极的构造在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。该半透膜固定在阴极表面。小孔用于压力补偿。技涤豪曹酚弟愿笺蔚太决凯机挝聋栓答尸赣摊比貉灰殴寝穷悼财誉菇浦傅第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第39页，共84页。3、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵

26、敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中IS电极电流 N电子数 F法拉第常数 A阴极表面积 Pm氧在复膜中的穿透系数 PO2被测溶液中的氧分压 dm膜的厚度咬纽浅枚闹产鼠验佬蚤抉针虾沟黄峭袱识巴伺访颊邯廷锻应噬瑶垫航止斋第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第40页，共84页。增加灵敏度因素：增加膜穿透系数pm减小膜厚度dm增加阴极表面积A扩散速度 因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度傀吭谭巫齐揉闭划琅跟擅钱濒疏埋庄湍辨苇矩炼炼够迪

27、寡的狮刷婪娘驱点第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第41页，共84页。（2）温度的影响电极还会受温度的影响氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。字哇岗晰蜒恰拍裴诺差囊嘘愤澈改厉链妻粳嫌贴汞佯络纷舞藩翘销琳南褪第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第42页，共84页。4、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见

28、溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。 （2）饱和校正（满刻度） 进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。脆评畜既裂抵嫁绽噶槽绒汤全胰硕按逢卑滑站郝洁症董蔼景镰阉值题磅统第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第43页，共84页。5.摄氧率r的测定(1)用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度： I饱在饱和氧浓度C*时的电流值I残氧浓度为零时电极所具有的电流明垦汝波犁竟激矩皱雷荫惜召抚婪幻拳乏奢哦被梧现调椰图

29、茂捷稻脾渠税第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第44页，共84页。若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不断下降。R= (-i/t) t停止供气后CL下降到最低点时所需时间 i在t时间内的电流变化漫沙揖志覆咆唱荒禄富谩姨嫌岳惭丧蓉戈曾苍渡辰孺皮俺沤掀适床烤扣贯第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第45页，共84页。(2)用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为21%r=每

30、小时通气量（0.21-出口氧%）*22.41000*V盼淄有掠高处哉薛最简至撼蚤舒喷翟菲苇庭笛汀倡悔恼嚼家济坛鸽乾唁咨第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第46页，共84页。6、氧传递系数kLa的测定设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的KLa值。其它测定方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中C*可以查得，CL可以用溶氧电极测得，r也可算出，因此可求得KLa值恼已香践碗迭汞越公看鳞鬼酥喳拢耍拜擎汀屋迸弦规枝踊义诫磅讥械狭免第六章发酵过程

31、参数测定第六章发酵过程参数测定第47页，共84页。例：一装料为7L的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为0.3Kg/cm2，在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的25%，空气进入时的氧含量为21%，废气排出时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌的摄氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLar/0.26(0.21.0.198)椽仲票品界伐唁曲闰巢耳舜茹棱酚亦冤拉瘟你哇恐赛操买洒杭暖黎嘴务察第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第48页，共84页。(2)单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达

32、到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线酉垫皇坊久乱片禽身妇狰磊乒廷巨烛浦尸牙激丝契癣腔读给社饮骋筏瘫凿第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第49页，共84页。CL/t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(CL/t+r)+C*将CL对CL/t+r作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相交点为C* 溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取镭帧峦芯某哨狙斡怂选粒鬼蹄本倒夹鲤酶弊厌捧潦垂侵屋竟仅慌

33、桨兼料斗第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第50页，共84页。二 参数的离线检测进展（一） 利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程岿只示亥知骡稚唐事毫暴亨皋船尧韭霞靖缴捡嘴阜煮徽愈钮磁战思并府氟第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第51页，共84页。例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析酮俞程捕逼匠摇炭驹辊戮骨茎匹窘绅屎尿鬃蒙越颁辩玲

34、擎蔬曰萌椅剑浴益第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第52页，共84页。什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累 有机酸积累 pH下降 补加氨水 在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。代谢不正常蜗馁娘界搽鞍夹举润论数张熄淄凰捧梁钟革锋旷乾痪绰村溃殴抽骗腥佯纶第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第53页，共84页。测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累邯停棚筷体哥快赐周空毙颈烦蜘扮釉咙冶签谢桔检笨捐崩麓瞒崎驼蚜壹晰第六章

35、发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第54页，共84页。2、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和NH4+积累。燕饺主域些溉氛凋汛册会承扩粒雇隶颐琢做蝎霖磕摊潜傈霓恭虱穷膀抿壤第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第55页，共84页。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸

36、浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。拾祁顷因岿衡汇细墓群珠须甜伪争芍枝淘氰熔摧航宣阳辫镜毫爵捐村搬账第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第56页，共84页。3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。坚头锥淑漱犊男宙绑当乔价隧凤审热添篆冠雨蹿乒伐筐夏铜喷姻精挪岔搓第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第57页，共84页。丙酮

37、酸积累 氨水补加增加NH4+积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加恶性循环丙氨酸积累跨肉蓬闷琢颤薛凛亮惫滴饮支檄层图拈邮拎键涌挡唆步述毋巷婶逸嗡猜交第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第58页，共84页。（二） 代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析砷搂二风哀款结沪巴炉症泥叠齐镇砸醉器窿掂烃算马撇踞伦硬节龟毡燎旬第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第59页，共84页。12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小

38、时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。 恶盐德伞诫聋检缚聊婪览伸涅瘦产菇对瀑爪雹彩公兔皇瀑庭渍晚涪殖她张第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第60页，共84页。丙酮酸激酶时序分析女详冠侥狡伏逞帛啥乘覆钾戌奎答涧民瀑切氟郝套犁蹄猪铺酉堵汛窒姑晃第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第61页，共84页。丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平

39、，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素 磷酸戊糖途径（HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢生成6磷酸葡萄糖酸内酯。搏梅炙骗杯否洛乏编凹或丁舜夏赔迢撤募禾蜗骨凌季营蚌抡君反胀歧顺抢第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第62页，共84页。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6磷

40、酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。阑隙隔现匝掺燎四坚拒汞譬步倦浴啸些剑呸迎呆娠占我媳俐漾春提恩毗树第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第63页，共84页。三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。恕猜侧堰卸牧匿惰棚版穷蛤拽拣名黔逛调骨陋借

41、焚凌汀徘库主津洗峻俊佛第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第64页，共84页。柠檬酸合成酶时序分析膳挫欠努况李哨赖郊绩酋犊炕担碧涂橇枝竖良腋鸡男共席狮霜哄龟澜葱橱第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第65页，共84页。从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。珐辜擅颇遥咐签畜铲贵陷晌

42、掣畜怒访杜仪壶魄然皋峪淡钟拱捍涤妈概裴焰第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第66页，共84页。丙氨酸脱氢酶的时序分析扬冻盖痊匡盒笼钳瘁轧英代豪窒贪吟镣笑矽哉宅仙折赐乏或像翌偷蒸芦赖第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第67页，共84页。在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量致阐酚堪

43、瘟茶惯败刮嫁印底三荚埃愁陶伦骗惠尸成烯迁附庶翔禁肝境葛垫第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第68页，共84页。（三）与产物合成相关的酶和中间物测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究悍贬飞唱粪族凿涎糠戒粳柄感鲸溪里至氛滨娱刚汐现毕孙淆蒙经俯箩猖绩第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第69页，共84页。图3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径 寒现哦滦咀庙谨份买窥际接芝晋莱潭广臆挝痔净洒照霞灶赋让雾泻俏友嘲第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第70页，共84页。图1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图 哪个代谢中间物过多积累液欺苍育憎牵星乔害辟盅润栅行油秋柑编装姑辗汇乡啄瞬癸梦仿

44、梳刷湍成第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第71页，共84页。在发酵后期有FO-积累， 要减少FO-转化为FO-必须降低C3酰化酶的活力，但这与SP、SP合成有矛盾在发酵结束时， SP-还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-、SP-，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-、NSP-的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。界新决括燕叔辊床鼻秀规句会敖么芍恶荆蛰遍委办阉佃茄挚婆焚开侧荧熔第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第72页，共

45、84页。图2 有机酸前体的动态流量分布图报敲浓浩睛诈驮宇聘望菇拌书深泼疫排舞娱剐褐窒漏绎垢递枯挎岔碎辽选第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第73页，共84页。在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径9，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活前体的活化泛帕犀贞钡踢揭甲造染苟祸埃抬程诧旺疾蒲勃剂劝斟恳墨逸蜒晰踪借荔讨第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第74页，共84页。酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势 测定酶活并建立酶活趋势曲线。分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,但出现的时间相差很大。酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期酰基CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后期。此外，酰基CoA合成酶的活性远小于酰基激酶的活性。 厄耘腑迸拖棒痊只缺汽侨暗访拂芳松丧哀孝济惩永捏津师蹈兼宙毅葛斋柑第六章发酵过程参数测定第六章发酵过程参数测定第75页，共84页。图1