人类心房颤动遗传学中的下一代测序

1、介绍当国际人类基因组测序联盟于2001年2月在自然杂志上发表了人类基因组的初稿时，这是一 项新颖的基准成就。该文章概述了整个基因组30亿个碱基对的序列。人类基因组计划的目的是提供 一个已知且可靠的遗传信息平台，以更好地了解人类DNA序列并识别所有基因。最终，全序列完成 并出版2003年4月，此外，预计从绘制基因组中获得的知识将导致开发新的诊断分析、靶向治疗和更有效的预测疾病发作、 严重程度和进展的方式。随着人类基因组慢慢变得越来越清晰，并被医学界更好地理解，它将对医疗 实践产生重大影响。最近，遗传信息被用于识别罕见和未确诊遗传疾病的突变，以帮助选择最适合特 定基因型的疗法。许多并行化的高通量技

2、术（例如微阵列和下一代测序）使这成为可能。在这篇 综述中，我们讨论了高通量技术在寻找重要的人类心律失常、心房颤动的易感基因或疾病机制方面的 可能应用。下一代测序技术在过去几年中，自动化Sanger测序在基因组分析中的应用发生了根本性的转变。自动化Sanger方 法被认为是“第一代”技术，较新的方法统称为下一代测序（NGS）。这些不断发展的主要下一代测序技术各有利弊，表1以概览形式列出了这些技术。表格1列出优缺点的主要下一代测序技术概述平台读取长度（碱基）吞吐量（每次运行）优点缺点罗氏454 GS初级40035兆字节更长的读取长度会改善重复区域映射运行时间快低成本仪器吞吐量低复杂数据分析生命固体

3、35-7530 Gb低错误率灵活性和可扩展性复杂数据分析仪器成本高序列生成Illumina MiSeq35-1501.5-2 Gb低成本仪器低错误率运行时间短可接受的读取长度复杂数据分析数据生成成本高高水平的多路复用平台读取长度（碱基）吞吐量（每次运行）优点缺点离子激流个人100-2001 Gb直接信号检测吞吐量低基因组机器运行时间短可接受的读取长度太平洋生物科学3000-5000100兆字节超长阅读仪器成本高帕比奥RS极高的精度测序成本高最短运行时间下一代测序应用RNA 序列（RNA-seq）NGS技术可用于许多应用，包括RNA序列（RNA-seq）。转录组是一组转录本，包括细胞中的 mRN

4、A、非编码RNA和小RNA，以及它们的数量。了解转录组对于解释特定的发育阶段、生理状 况和疾病至关重要。RNA-seq包括通过对感兴趣的目标区域或全基因组重新测序、细菌和真核生物 基因组的从头组装以及对细胞、组织和生物体的转录组进行编目来发现变异。心房重构是心房颤动的 主要机制。心房重构的RNA表达谱可以检测心房对这种复杂心律失常的适应，并识别参与该机制的 基因，或使这种复杂心律失常持续的机制。以前，互补DNA微阵列已被用于研究心房颤动中的表达 谱。微阵列基于一组预先指定的基因筛选基因表达作为参考。在使用NGS的RNA测序中，没有先 验地指定基因，新的测序技术对心房组织中存在的所有RNA （转

5、录组）进行测序，并在心房颤动患 者的心房组织和对照的心房组织之间进行比较，以确定哪个基因（s）在心房颤动的生理适应过程中被 激活，或心房颤动的机制。芯片序列（ChIP-seq）一种用于分析蛋白质与DNA相互作用的新方法是染色质免疫沉淀和测序（ChIP-seq）。该ChIP-seq 将染色质免疫沉淀（ChIP）与大规模平行DNA测序相结合，以识别DNA相关蛋白的结合位点。它 可用于精确绘制任何感兴趣蛋白质的全局结合位点，并且是一种对DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核 小体进行全基因组分析的技术。这种ChIP-on-chip技术是用于研究这些蛋白质-DNA关系的最常用 技术。由于采用了新一代测序技术，

6、ChIP-seq比之前基于阵列的方法ChIP-chip具有更高的分辨率、 更低的噪音和更大的覆盖范围。NGS技术可用于筛选DNA结合蛋白的全基因组分析，表观遗传标 记和染色质结构（ChIP-seq、methyl-seq和DNase-seq）。ChIP也已成为了解转录级联和解释染色质 中编码信息的有用工具。此外，在测序之后，ChIP-seq成为主要的分析方法。为了从ChIP-seq数据 中提取最多的信息，与其他数据类型的综合分析将是必不可少的。例如，ChIP-seq数据与RNA-seq数 据的整合可能导致基因调控网络的阐明以及转录组和表观基因组之间相互作用的表征。ChIP-seq在心房颤动中的应

7、用包括对参与心房颤动机制的特定转录因子（如STAT3）进行遗传分析， 并通过甲基-seq建立那些可能有助于识别参与心房颤动表观遗传机制的新基因的表观基因组标记。心 房颤动，以前从未解决过。宏基因组学另一种方法是宏基因组学，它基于微生物DNA的基因组分析，微生物DNA直接从环境样本中的 微生物群落中提取。目前，人们普遍认为AF不是由微生物引起的，尽管确实存在这种机制的可能 性。宏基因组学可用于研究物种分类或基因发现。通过将收集到的信息与有关群落内生物功能的信息 相结合，可以潜在地探索微生物群落的结构。宏基因组学还可以解锁环境中存在的大量未培养微生物 多样性，为治疗和生物技术应用提供新分子。常见疾

8、病遗传力缺失常见疾病遗传力缺失可能是NGS技术在当前常见疾病或复杂性状疾病（包括房颤、高血压或2型糖 尿病）的遗传研究中最重要的应用。关于复杂遗传性状的遗传基础有两种假设。“常见疾病-常见变异” 由许多影响较小的常见等位基因组成，“常见疾病-罕见变异”由少数产生较大影响的罕见等位基因组 成。然而，这两种类型的基因位点都可能存在，“常见疾病-常见变异”是全基因组关联研究（GWAS）的 理论框架。，经过多年的持续努力，GWAS生成的大部分数据已经发布。在成功的GWAS研究中， 大多数发现的变异只赋予一小部分遗传力，表明基于“常见疾病-常见变异”的GWAS在识别复杂性状 的遗传变异方面不是很有效，而

9、常见的遗传变异不太可能解释对疾病的整体遗传易感性。结果还表明， GWAS遗漏的罕见变异可能是“遗漏”遗传力的原因。这种罕见的变异可能与复杂遗传疾病的遗传风 险因素一样大。通常，这些罕见的变异可以从一种常见疾病的家族形式中识别出来。例如，房颤是一种常见病；然而， 有几个家庭的房颤在多个家庭成员中分离。在钾通道中发现了几个具有大影响（离子电流密度的显着 扰动）的突变或变体。-然而，在常见心房颤动的大样本中筛查这些变异未能确定这些钾通道突变在 常见心房颤动机制中的作用。，使用新的NGS技术鉴定其他罕见变异可能是可能的，这些技术涉及 来自极端表型（例如药物难治性心房颤动）患者的DNA样本。这些罕见的变

10、异被认为是在易感基因 的编码区内，会引起很大的病理生理作用。因此，外显子测序成为识别疾病易感基因内遗传变异的另 一种流行工具，特别是在通过全基因组方法（即所谓的全外显子组测序）进行探索时。全外显子组测序复杂性状疾病遗传研究的剩余挑战之一将是定义“缺失”遗传性的遗传基础。NGS技术无疑将使我们 能够识别所有致病变异，包括个体人类受试者中的“稀有变异”。例如，“全基因组测序（WGS）”将使 我们了解复杂疾病的遗传贡献，以及基因组学的遗传基础。全基因组序列数据的分析可能具有挑战性。 由于目前理解非编码变异的能力有限，大多数“全基因组”研究的分析组件都集中在“整个外显子组”内 的变异上。全外显子组测序

11、（WES）是一种选择性捕获和测序所有带注释的蛋白质编码基因的编码区 的技术。结合新一代测序平台，它能够以前所未有的效率分析人类基因组的功能区域。自首次报道应 用以来，WES已成为研究人员阐明人类疾病的遗传变异的强大而流行的工具，特别是在搜索稀有 或新型变异的背景下。如前所述，罕见或新的变异可能是导致心房颤动遗传性缺失的原因，并且在某 些特定患者人群的心房颤动机制中可能很重要。由于不断改进，测序技术已成为复杂基因组研究的首选方法。我们现在正在见证其转化为涉及患者护 理的临床诊断实验室的使用。现在，基于靶向基因富集和下一代测序，多个临床实验室可以获得针对 各种疾病的多种基因。蛋白质编码区的全基因组

12、研究或外显子组测序已成功并越来越多地应用于阐明 具有多种罕见和复杂遗传疾病的个体和家庭的候选基因和因果变异的研究环境。基于这一进展，外显 子组测序也开始向临床实践转化。然而，由于数据量非常大，引入外显子组测序作为诊断工具带来了 新的技术和生物信息挑战。此外，大多数情况下，可以识别多个编码区变异，使临床医生无法确定哪 个是真正的致病变异。未来方向和挑战最近在NGS领域的研究非常令人鼓舞。然而，为了在临床实践和基因研究中广泛和常规地使用，还 需要额外的努力，例如数据生成、分析、管理以及采取措施降低测序成本。现在剩下的主要挑战是围 绕这种遗传信息制定易于解释的规则和政策，并使基于测序的基因测试能够负

13、担得起。这将需要研究 实验室、临床医生和生物信息学研究人员之间的持续合作。靶向重测序已被用于识别潜在疾病的基因突变，如炎症性肠病、遗传性听力损失、米勒综合征、歌舞 伎综合征和遗传性痉挛性下肢轻瘫。对其他复杂性状疾病的可能应用令人鼓舞，并需要额外的合作研 究。NGS数据分析是一个不断发展的领域，也可能是常规采用的最大瓶颈。用于诊所的NGS数据分析 解决方案需要简单、快速和准确，并且应该创建易于被医务人员解读的输出。与拥有大量可靠且经过 验证的分析解决方案提供几乎类似于医疗报告的输出的微阵列不同，NGS数据分析仍然主要使用开 源工具进行。-这些开源工具在研究实验室分析NGS数据方面非常有用，但它们不能用于临床。此 外，商用NGS数据分析解决方案旨在处理研究环境中产生的大量数据，但并未从临床角度进行设计。由于现有理解非编码变异的能力有限，大多数“全基因组”研究的分析组件都集中在“整个外显子组”内 的变异上。随着测序成本的不断下降，该领域可能会逐渐从外显子组转向全基因组测序。然而，将这 些更全面的数据用于患者的疾病基因发现和分子诊断，关键取决于理解非编码变异的分析策略的发 展。有成千上万个定义不明确的家族表型是罕见的或