高效液相色谱分析法课件

1、第二十章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法的主要类型和原理二、高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择三、高效液相色谱仪四、高效液相色谱分析方法high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph2022/7/30 概述高效液相色谱法（high performance liquid chromatography；HPLC）是在60年代末，以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。它与经典液相色谱法的主要区别是：流动相改为高压输

2、送、采用高效固定相、具有在线检测器、仪器化。2022/7/30二、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2022/7/30一、HPLC与经典LC区别经典LC 与HPLC的主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化

3、合物2022/7/303、容量因子及其影响因素组分为弱酸时：流动相pHpKa，k值变小， tR 减小。组分为弱碱：流动相pHpKb，k值增大，tR增大;流动相pHpKb，k值变小， tR 减小。流动相的pH需在28之间，超出此范围可能使键合基团脱落。实验后，应及时用不含缓冲盐的流动相冲洗，以防腐蚀仪器流路系统。 2022/7/304、用途有机弱酸、弱碱与两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。不适用于pka8.0的碱。离子抑制色谱法与离子对色谱法比较ISCPICpka3.0的酸pKa 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚

4、 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2022/7/305. 选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2022/7/30一) 流动相对分离的影响高效液相色谱中，良好的固定相容易获得，改善分离效果主要是靠选择流动相。主要受溶剂种类的影响；k主要取决于溶剂的配比

5、。2022/7/30二) 溶剂的强度和选择性1. 溶剂的极性和强度2. 混合溶剂的强度3. 溶剂的选择性2022/7/30Snyder溶剂分类法样品组分、溶剂与固定相三者间的作用力为分子间作用力，组分的分配系数由三者的分子间作用力所决定。分子间的作用力可分为以下三类：质子受体作用力 参照物：乙醇质子给予作用力 参照物：二氧六环强偶极作用力 参照物：硝基甲烷选择以上作用力最强的常用溶剂作为参照，将81种常用溶剂分为八类。2022/7/30Snyder溶剂分类法选择不同组别的溶剂，分子间作用力不同，容易造成组分间的分配系数的差别，使改变，以利于组分的分离。根据各类参照物推算出常用溶剂的极性参数P/

6、和反相洗脱溶剂的强度因子S值。选择不同极性参数P/的溶剂（正相）或不同强度因子S的溶剂（反相）进行配比，优化分离效果。2022/7/30三)溶剂最优方法-四面体优化法根据色谱类型（正、反相）组成四面体；寻找被分离组分的容量因子k=3的等洗脱面ABC；将此等洗脱面视为正三角形按比例配制等洗脱强度的初试溶剂。用初试溶剂作为流动相，进样，检查分离效果，选择最好的溶剂系统。2022/7/30色谱溶剂系统的四面体优化法ABC0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67BDB/A/C/

7、AC2022/7/30应用实例11种磺胺混合物的分离组成溶剂四面体甲醇、乙腈、四氢呋喃底剂：水B水乙腈甲醇四氢呋喃AC2022/7/30应用实例11种磺胺混合物的分离寻找等洗脱强度面用ODS键合相柱与甲醇-水，分离上述混合物。经数次调整配比，在甲醇-水（20.0:80.0）时，样品中保留时间适中组分的k=3（或25）。 tR=t0(1+k)该号溶剂强度因子：Sab=3.00.2+00.8=0.6所有配比溶剂系统的强度因子都为0.6。2022/7/30应用实例11种磺胺混合物的分离MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33

8、/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67按比例配制等洗脱强度的初试溶剂2022/7/30应用实例MeOH-H2O(20:80)CAN-H2O (18.8:81.2)THF-H2O (13.3:86.7)MeOH-CAN-H2O (10.0:9.4:80.6)ACN-THF-H2O (9.4:6.6:84.0)MeOH-THF-H2O (10.0:6.6:83.4)MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0

9、.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.672022/7/30应用实例11种磺胺混合物的分离用初试溶剂作为流动相，进样，检查分离效果最佳流动相： MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)2022/7/30洗脱方式恒组成溶剂洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。优点： 缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度。缺点： 有时引起基线漂移；重复性不佳。2022/7/30续前 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似G

10、C的等温度洗脱2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）2022/7/30三、分离条件的选择1 2022/7/30影响分离的因素 factors influenced separation1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2022/7/30 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质

11、阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2022/7/30 2.流速 流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2022/7/30一)高效液相色谱法的速率理论1.2022/7/30一)高效液相色谱法

12、的速率理论HPLC是将LC与GC基本原理和实验方法相结合而产生。两者主要差别是流动相性质不同Van Deemter方程式： GC H=A+B/u+Cu 毛细管开口柱 H=B/u+Cu HPLC H=A+Cu （流动相是液体，粘度比气体大的多，柱温为室温，而且流速至少是最佳流速的3-5倍，综上原因可忽略纵向扩散项）2022/7/30图示back2022/7/30影响HPLC色谱峰宽的因素涡流扩散项AA=2dp降低固定相直径dp (3-5m)降低。采用球形、仄粒度分布（RSD5%）固定相及匀浆装柱。2022/7/30影响HPLC色谱峰宽的因素纵向扩散项纵向扩散系数:因流动相黏度大,组分的纵向扩散系

13、数很小,纵向扩散项可以忽略.2022/7/30影响HPLC色谱峰宽的因素传质阻抗系数C GC C=Cs HPLC C=Cm+Csm+Cs化学键合相，固定液为键合在载体表面的官能团的单分子层 HPLC C=Cm+CsmVan deemter方程在HPLC中的表现形式： HPLC H=A+Cmu+Csmu2022/7/30续前3）传质阻抗项及其影响 2022/7/302022/7/30HPLC分离条件的选择采用小粒度、仄分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。采用低粘度流动相，低流量（1ml/min）。柱温以25为宜。太低，则使流动相的粘度增加。用水溶液为流动相的色谱法（如IEC）可按需升

14、温。2022/7/30其他(自学)正相键合相色谱的分离条件反相键合相色谱的分离条件反相离子对色谱的分离条件2022/7/30四 其他固定相(自学)键合型离子交换剂手性固定相亲合色谱固定相2022/7/30五、分离类型选择 choice of separation types2022/7/30第二十章高效液相色谱分析法一、输液系统二、分离与进样系统三、检测系统四 数据记录处理和 计算机控制系统第三节高效液相色谱仪high performance liquid chromatograph2022/7/30一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph2

15、022/7/30液相色谱仪（2）2022/7/30液相色谱仪（3）2022/7/30液相色谱仪（4）2022/7/302022/7/30二、高效液相色谱仪2022/7/30三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.流程2022/7/30第三节 高效液相色谱仪微机泵贮液瓶检测器记录器级分收集器预柱分析柱柱恒温箱自动进样器进样器进样2022/7/30一、高压输液泵(1) 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之

16、一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2022/7/30一、高压输液泵1、柱塞往复泵2022/7/30输液泵的要求：无脉冲、流量恒定、流量可以自由调节、耐高压、碉腐蚀、适于进行梯度洗脱2022/7/30(2)梯度淋洗装置外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2022/7/30二、分离和进样系统完整的分离和进样系统包括进样器、色谱柱、柱的进出口接头及至检测器的导管。1、进样器 六通进样阀2022/7/301. 进样装置 流路中为

17、高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：2022/7/302022/7/30(4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2022/7/30二、色谱柱2、色谱柱 分析型：内径24.6mm，柱长1025cm 制备型：内径2040mm，柱长1030cm3、色谱柱柱效的评价 “色谱条件与系统适用性试验”给出分析状态下色谱柱最小理论塔板数、分离度和拖尾因子。2022/7/30(5) 液相色谱检测器2022/7/30三、检测系统一) 检测器的要求：灵敏度高;噪声低;线性范围宽;重复性好;适用化合物的种类广。2

18、022/7/30三、检测系统可变波长型检测器光电二极管阵列检测器2022/7/30覆盆子指纹谱图2022/7/30板蓝根指纹图谱2022/7/30三、检测系统二)、紫外检测器UVD优点：灵敏度高，噪音低，不破坏样品可用于制备，对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：只能检测有紫外吸收的样品；流动相选择有一定限制，检测波长必须大于流动相的截止波长。2022/7/30二) 紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 工作原理为Lamber-Beer定律 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选

19、，易于操作； 可用于梯度洗脱。 2022/7/301. 可变波长检测器原理与紫外分光光度计类似.2022/7/30可变波长紫外光测定器示意图2022/7/302. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2022/7/302022/7/30光电二极管阵列检测器2022/7/30三) 荧光检测器（fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2022/7/30四). 示差折光检测器（d

20、ifferential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；2022/7/30示差折光检测器2022/7/30五) 其他检测器1. 安培检测器2 蒸发光散射检测器2022/7/30 第二十章 高效液相色谱 法一、定性分析方法二、定量分析方法三、高效液相色谱 分离方法的选择 第四节 高效液相色 谱分析法high performance liquid chro

21、matograph2022/7/30第四节高效液相色谱分析方法一、定性分析方法色谱鉴定法化学鉴定法两谱联用鉴定法两谱联用法（离线）两谱联用仪（在线）2022/7/30二、定量分析方法(与GC类似)1、外标法以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量。工作曲线法、外标一点法、外标二点法进样量必须准确，否则宣布误差大。外标一点法只有在工作曲线通过零点时才准确。2022/7/30二、定量分析2、内标法工作曲线法内标一点法内标二点法内标对比法校正因子法。2022/7/30三、分离方法的选择 choice of separation types2022/7/30 第二十章 高效液相色 谱分析法一、超临

22、界流体色谱的特点与原理feature and principle of SFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structure and general process of SFC 三、超临界流体色谱的应用application of SFC 第五节 超临界色谱high performance liquid chromatographsupercritical fluid chromatograph, SFC2022/7/30一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述 超临界流

23、体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。2022/7/302. 超临界流体性质（1）性质介于液体和气体之间; 具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。 超临界流体的密度与压力有关。2022/7/303.原理 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC； 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离； 通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；2022/7/30压力效应： SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）； 超临界流体的