药物分析中的新技术、新方法课件

1、 药物分析中的新技术、新方法第一节：手性药物的色谱分析法一、手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）天然和半合成药物（556）合成药物（1436）非手性药物（857）单一异构体（73）外消旋体（506）手性药物（547）非手性药物（9）单一异构体（537）外消旋体 （10）二、手性药物对映体的药效学差异1. 治疗作用完全依赖一种异构体。2. 药理作用差别不大。 如：异丙嗪3. 药理作用类似，但反应强度有差别。4. 药理与毒理作用存在“质”的区别。三、手性药物对映体的药动学差异： 1. 吸收。 2. 蛋白结合。 3. 代谢。四、手性衍生化特点：需要高光学纯度的手性衍生化试剂；反应繁琐费时

2、；衍生化反应速率重现性较差；使用价格便宜、柱效较高的非手性柱；衍生化过程可同时纯化样品。 1. 间接法拆分对映异构体即衍生化试 剂法（CDR）。 2. 直接法拆分对映异构体。 手性固定相法（CSP） 手性流动相添加剂法（CMP）五、手性药物拆分的高效液相色谱 法分类： 采用非手性固定相如:柱前衍生化-反相高效液相色谱法 拆分酮洛芬对映异构体S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬 酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图酮洛芬对映体的柱前衍生化方法：酮洛芬对照品溶液(1 mg/mL) 0.1 mL加入正己烷0.6 mL二氯亚砜溶液0.2 mL751 h冷却至室温吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL5 min

3、振摇加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL混匀吹干后溶解进样二氯甲烷:乙醚2:1色谱条件色谱柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0mm ID， 流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺 (55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，流速： 1 ml/min, 检测波长：254 nm酮洛芬对映体衍生化物色谱图：RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tRs=7.3 min，tRr=8.5 min，分离度为1.9常用的手性固定相： 1） Pirkle型相. 2） 合成多聚相. 3） 环糊精键合相.特点:1）适用范围广2）制备分离方便3）定量分析的可靠性高4）价格昂贵奈基乙脲键合硅

4、胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱图3. 手性流动相添加剂法-CMP 将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与药物消旋物中各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对映体的分离。常用的手性添加剂：1） 配基交换型手性添加剂2）手性离子对络合剂3）环糊精添加剂(CD)17特点：1）可采用普通的非手性固定相2）不需对样品进行衍生化3）手性添加物的可变范围较宽第二节：高效毛细管电泳（HPCE） 毛细管电泳（Capillary electrophoresis, CE）也称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管电分离法（CESM），是一种以毛细

5、管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。由于CE可以分离从离子到中性分子；从小分子到生物大分子的一系列化合物，尤其是以生物工程为代表的生命科学领域中的多肽、蛋白质、DNA的分离。因此，CE被认为是当代分析科学中最具活力的前沿研究领域。高压电源毛细管恒温系统检测器数据处理系统毛细管缓冲液/样品缓冲液（+）()毛细管电泳装置示意图 在柱检测器 HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点： 1. 高效率：柱子长，故理论塔板数大。 2. 高灵敏度：CE分离后一般用激光诱导荧光检测法（LIF）或安培电化学检测法（EC），可检测到10-19m

6、ol/L，甚至到单细胞检测。 2. 高速：做一个样只需几十秒到几十分钟。 3. 微量：进样1L即可。 4. 低成本： 5. 易于自动化：（一）基本原理：v = veo+ vep = (eo+ep) E veo:电渗流速度； eo: 电渗流淌度 vep:电泳流速度；ep: 电泳流淌度E：电场强度； v: 迁移速度+()( + )电渗产生示意图：()+-毛细电泳中不同组分的迁移示意图：( + )27 （二）主要分离模式： 1. 毛细管区带电泳（CZE）； 2. 胶束电动毛细管色谱 （MECC）； 3. 毛细管凝胶电泳（CGE）； 4. 毛细管等电聚焦电泳 （CIEF）； 1. 毛细管区带电泳：（c

7、apillary zone eletrophoresis, CZE） 是最基本、最常用的分离模式。 适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能分离中性物质及质荷比相同的组分。 2. 胶束电动毛细管色谱： （micellar eletrokinetic capillary chromatography, MECC） 用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。 3. 毛细管凝胶电泳： （capillary gel eletrophoresis, CZE） 凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质

8、荷比相同但分子大小不同的组分。 在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。4. 毛细管等电聚焦电泳： （capillary isoelectric focusing, CIEF） 根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低模式缓冲液体系分离机理CZE自由缓冲液离子淌度MECC胶束缓冲溶液疏水性/离子性相互作用CGE凝胶缓冲溶液分子大小和荷电数目CIEF两性电解质等电点分离模式小结：毛细管区带电泳胶束动电毛细管色谱毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦应用：1. 监测药物生产过程 如：监测青霉素

9、发酵液中有关物质的量。青霉素发酵液的高效毛细管电泳图：1. 青霉素G钠 ；2. 6-APA ；3. 对羟基苯乙酸 ；4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸2. 中药成分分析 如：黄酮及其甙类分析黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图：1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素；5. 汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素3. 手性拆分4. 体内分析第三节：质谱法及其应用进样系统离子源质量分析器检测器控制和数据处理系统真空系统一、离子源及离子化技术 1、EI（电子轰击离子化）V加速电压试样蒸汽阴极阳极电子束离子xyz电子轰击质谱示意图： 优点： 灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成熟

10、的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的有力手段；重现性好，有标准图谱，可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。 缺点： 样品须汽化后才可离子化 适用化合物： 易挥发、热稳定化合物。 2、CI（化学离子化） 软电离技术 优点： 可以得到较强的准分子离子峰，有利于分子量的测定。 缺点： 样品须汽化后才可离子化。 适用化合物： 易挥发、热稳定化合物 。+快原子枪样品靶原子束质量分析器二次离子束快原子轰击质谱示意图:3、FAB（快原子轰击离子化） 软电离技术： FAB的特点： 优点： 样品不须汽化；既给出化合物的分子量信息，又给出结构信息。 适用范围广，仪器商品化较早，普及率高。 缺点： 重现性差，灵敏度较

11、EI低。 适用化合物： 极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。 4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化） 软电离技术 优点： 通常只给出分子离子峰（或准分子离子 峰）。 适用化合物： 蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子。5、API（大气压离子化） 软电离技术 （1）ESI（电喷雾离子化） 特点： 能够产生多电荷离子。 适用化合物： 对生物大分子及其他分子量大的 化合物的分析较有利。+毛细管+ 4kV含离子的液滴随液滴蒸发，电场加强，离子向表面移动离子从表面蒸发离子蒸发机理：（2）APCI（大气压化学离子化） 最软的电离方式之一 特点： 一般只给出化合物的分子量信息，通过源内 CID（碰撞诱

12、导分解）可同时获得结构信息。 适用化合物： 与ESI比较，更适于分析极性及分子量 小（1000 amu）的化合物。反应气等离子体Corona放电电极真空样品+溶剂雾化气加热管APCI电离原理：二、质量分析器及质量分离原理 1、扇型磁场质谱仪。 2、四极质谱仪。 3、飞行时间质谱仪。 4、离子阱质谱仪。亲子鉴定亲子鉴定方法 亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。原始的亲子鉴定方法 外貌对比法：通过外貌长相的对比来确定亲子关系恐怕是最原始的方法，但这样方法只是一种猜测、判断，作为一种参考。

13、滴骨验亲法：滴骨验亲法就是将生者的血液滴在死人的骨骸上，若血液能渗透入骨则断定生者与死者有血源关系，否则就没有。这种方法并不科学，但开创了用血型鉴别血源关系的先河。 滴血验亲法：滴血验亲法又称合血验亲法，就是将小孩的血与大人的血液放在一起，如果能融在一起，就是父母亲生的，否则就不是亲生的。这种方法没有科学依据，亲子关系的血液不一定能融合，而非亲子关系的血倒有可能融合。现代的亲子鉴定方法血型测试：血型测试进行亲子鉴定就是通过对血型的检验比对来确定亲子关系。依据19世纪末被公认的孟德尔遗传定律，人们认识到人类的血型是按照遗传基因传给下一代，故一定血型的父母所生子女也具有相应的血型，这为血型鉴定亲子

14、关系奠定了基础。染色体多态性鉴定：20世纪80年代，医学家们又开创了使用染色体多态性鉴定亲子关系的技术，染色体多态性又称异态性（heteromorphism)，是指正常人群中常见的各种染色体形态的微小变异（如：随体增大、重复或缺如，着比粒区的荧光强度变异等），这种多态是可以遗传的。这项技术就是利用其形态来鉴定亲子关系，这要靠技术人员的主观判断，其准确率也不尽如人意。 DNA鉴定：鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定。一个人有23对（46条）染色体，同一对染色体同一位置上的一对基因称为等位基因，一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检

15、测到某个DNA位点的等位基因，一个与母亲相同，另一个就应与父亲相同，否则就存在疑问了。利用DNA进行亲子鉴定，只要作十几至几十个DNA位点作检测，如果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不同，则可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确率几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。 从专业角度来讲，DNA亲子鉴定是根据遗传学原理，用现代生物技术，对被鉴定者进行特定DNA片段的提取和检测，并对结果进行相应的计算分析，得出鉴定结论的过程。 DNA亲子鉴定的主要方法：DNA是从几滴血,腮细胞或培养的

16、组织纤内提取而来，用畴素将DNA样本切成小段,放进喱胶内,用电泳槽推动DNA小块使之分离-最细的在最远, 最大的最近，之後,分离开的基因放在尼龙薄膜上,使用特别的DNA探针去寻找基因,相同的基因会凝聚于一,然后,利用特别的染料,在X光的环境下,便显示由DNA探针凝聚于一的黑色条码。这种肉眼可见的条码很特别-一半与母亲的吻合,一半与父亲的吻合.这过程重覆几次,每一种探针用于寻找DNA的不同部位并影成独特的条码,用几组不同的探针,可得到超过99,9%的父系或然率或分辨率.DNA鉴定的具体步骤：1.破碎细胞，释放DNA 血中的DNA与核蛋白结合，位于血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了

17、使DNA从细胞核中释放出来，需要向血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。一般510mL的血细胞液加入20mL蒸馏水搅拌5min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。2溶解细胞核内的DNA 在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。3DNA的析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步是关键。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。注意加水太

18、多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。 用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4 000 r/min转速的离心机，离心15min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。4.DNA的初步纯化如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，会使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色白色。需要对DNA粗制品进行简单的提纯，将DNA黏稠物再溶解，继续用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用34层纱布进行过滤（或离心），滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。 DNA的纯化还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿异丙醇混合液（体积比为241），通过离心将蛋白质及其他杂质除