2013-实验八jinjing大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒dna转化

1、2022/7/291实验八 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化中山大学药学院2022/7/292一、实验目的二、实验原理三、实验试剂四、实验步骤五、注意事项讲授内容实验内容2022/7/293学习和掌握大肠杆菌感受态细胞制备的原理和方法了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习和掌握质粒转化的方法一、实验目的实验目的2022/7/294二、实验原理基因工程（genetic engineering）又称DNA重组技术，在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。实验原理2022/7/295 质粒

2、(plasmid)为小型环状双链DNA分子，在细菌体内能独立复制、转录，拥有启动子，编码区和终止子；由于环状结构，质粒进入菌体内不易被DNA外切酶降解，从而保证了它在非同种细胞间的转移，作为基因的载体，在基因工程中有用。实验原理质粒特点：1. 自我复制系统2. 限制酶切位点3. 抗性标记基因2022/7/296感受态细胞(competent cells)受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的分子通过的感受态细胞(competent cell) 。2022/7/297转化（transformation）是将异源DNA

3、分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株（R-M-）。实验原理2022/7/298化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 转化的方法：实验原理2022/7/299CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方

4、法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。CaCl2法制备感受态细胞实验原理2022/7/2910CaCl2法制备感受态细胞原理：细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。实验原理2022/7/2911重组DNA转

5、化细菌过程示意图实验原理2022/7/2912主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、氯霉素、四环素、链霉素等。克隆的筛选：实验原理2022/7/2913三、实验材料实验器材：冷冻离心机、水浴锅、恒温摇床、广口瓶、盐水瓶、已灭菌的微量移液管、玻璃仪器以及塑料离心管、EP管、枪头、培养皿等。 试 剂大肠杆菌DH5、EGFP-N3重组质粒 、LB液体培养基、20 mg/mL卡那霉素、LB固体培养基、0.1mol/L CaCl2实验材料2022/7/2914四、实验步骤1、受体菌的培养将DH5细菌接种在LB平板上，37 C培养过夜。从LB平板上挑取新活化

6、的E. coli DH5单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37 C下振荡培养12小时左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37 C振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。（摇瓶对比）实验步骤2022/7/29152、感受态细胞的制备（CaCl2法）将培养液（10 mL）转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4 C下3000 g离心5分钟。弃去上清，用预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液2 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15分钟后，4 C下3000 g离心10分钟。弃去上清，加入0.5mL预冷0.1mol/L的CaCl2

7、溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200 L的小份，贮存于-70 C可保存半年。（本次不分装，下一步取20 L ）实验步骤2022/7/29163、转化从-70 C冰箱中取20 L感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入质粒DNA溶液(含量5-50ng，体积2L)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。 同时做受体菌对照管： 20L感受态细胞 + 2L无菌水42 C水浴中热击90秒。实验步骤2022/7/2917热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 向管中加入100 L LB液体培养基(不含Kana)，混匀后37 C振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生长

8、状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Kana)。 将上述菌液摇匀后取30 L 涂布于含Kana的筛选平板上，待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37 C培养16-24小时。（第二天老师统一观察拍照）实验步骤注意：本实验中将采用两种感受态细胞，一种为自制感受态细胞，一种为购买的感受态细胞。涂板时用已灭菌的EP管圆头代替涂布棒进行涂布，将菌液均匀涂布。（参见视频）2022/7/2918自制感受态细胞质粒自制感受态细胞无菌水购买感受态细胞质粒购买感受态细胞无菌水倒板：从助教老师处取两管培养基。将Kana迅速加入培养基中，每管加入12uL卡那霉素。盖上盖子后，上下轻轻混匀2次。于酒精灯下，将培养基倒入平板

9、中，迅速盖上盖子，轻轻于桌面摇匀，静置，待培养基变成固体。于培养皿上标记。注意：质粒，市售感受态细胞，LB培养基，灭菌水和灭菌EP管到助教老师处领取。2022/7/29192022/7/2920五、注意事项1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于 C的培养菌，最好从70 C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。注意事项2022/7/29212、质粒的

10、质量和浓度：转化的质粒应主要是超螺旋DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。注意事项2022/7/29224、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压蒸汽灭菌处理，所有的试剂都要灭菌注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。注意事项2022/7/2923六、问题与讨论CaCl2法制备感受态细胞的原理。影响CaCl2法转化率的关键因素有哪些？如何提高转化率？涂布菌液时应注意什么？感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？如阴性对照中长出菌，原因？还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？实验讨论20