基因工程原理讲义：基因工程的酶学基础

1、 第五讲基因工程的酶学基础中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月目录一、导言1基因工程诞生的理论基础2基因工程诞生的技术基础3基因克隆中涉及的主要的核酸酶二、核酸内切限制酶与DNA分子体外切割1简介与定义2寄主控制的限制与修饰现象(1)限制与修饰(2)若干概念限制与修饰现象的解释限制与修饰现象的分子机理寄主控制的限制与修饰的生物学作用3核酸内切限制酶的类型(1)I型核酸内切限制酶(2)II型核酸内切限制酶4.II型核酸内切限制酶的特点基本特点识别位点平末端与粘性末端限制酶的识别序列与切割频率同裂酶同尾酶识别多核苷酸的限制酶5核酸内切限制酶的命名(1)命名原则(2)实际使用的名称6核酸内

2、切限制酶对DNA的消化作用核酸内切限制酶同靶DNA序列之间的结合模型核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化真核基因组DNA的酶切消化DNA的酶切消化体系7影响限制酶活性的生物因子及操作条件DNA的分子特性酶切消化反应温度DNA纯度影响限制酶活性的操作条件三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接1引言2DNA连接酶(1)定义(2)连接条件最佳连接温度影响连接反应的因素3粘性末端DNA片段的连接(1)连接过程(2)碱性磷酸酶的处理4平末端DNA片段的连接T4DNA连接酶连接法同聚物加尾法衔接物连接法DNA接头连接法四、热稳定连接酶1寡核苷酸连接测定(1)基本原理连接物检测用途2连接酶链式反应裂口连接酶

3、链式反应不对称裂口连接酶链式反应基因工程的酶学基础一、导言1基因工程诞生的理论基础第一，在上一世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；第二，在上一世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题；第三，在上一世纪50年代末期和60年代初期，科学工作者相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达的问题；*.遗传的物质基础、基因的复制与传递、遗传信息的流向与表达三大理论问题均得以解决。2基因工程诞生的技术基础第一，DNA分子的体外切割与

4、连接技术的建立此有赖于核酸内切限制酶与DNA连接酶的发现与应用第二，DNA分子核苷酸序列的结构分析技术Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert的化学修饰法第三，基因克隆载体的发展与应用质粒载体的发展与应用噬菌体载体的发展与应用第四，大肠杆菌遗传转化技术的建立20世纪70年代M.Mandel和A.Higa发现E.col细胞经过氯化钙处理后，便能够吸收噬菌体DNA。1972年斯坦福大学的S.Cohen等人发现，经氯化钙处理的E.coli细胞同样也能够摄取质粒DNA,从而建立了大肠杆菌的遗传转化体系。第五，琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用第六，核酸杂交技术的建立Southern杂交技术的

5、建立。*有趣的是，上述这些技术几乎都是同时得到发展的，并且迅速地被运用于基因操作实验。于是在20世纪70年代初期,开展DNA体外重组工作，无论在理论上还是技术上都已经具备了条件。SomeoftheenzymesusedinrecombinantDNAtechnologyEnzymesFunctionTypeIIrestrictionendonucleasesCleavingDNAatspecificbasesequencesDNAligaseJoiningtwoDNAmoleculesorfragmentsDNApolymeraseI(E.coli)Fillingingapsinduplexe

6、sbystepwiseadditionofnucleotidesto3endsReversetranscriptaseMakingaDNAcopyofanRNAmoleculePolynucleotideKinaseAddingaphosphatetothe5-OHendofapolynucleotidetolabelitorpermitligationTeminaltransferaseAddinghomopolymertailstothe3-OHendsofalinearduplexExonuclease皿Removingnucleotideresiclucesfrom3-endsofaD

7、NAstrantBacteriophage九exonucleaseRemovingnucleotidesfrom5endsofaduplextoexposesingle-stranded3endsAlkalinephosphataseRemovingterminalphosphatesfromeitherthe5endor3endorboth(FromLehningerP.986)注：关于“Gap”与“Nick”的概念。*1Gap裂口：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。GapinDNAistheabsenceofoneormorenucl

8、eotidesinonestrandofduplex.*2.Nick缺口：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了（移走了）一个磷酸二酯链。NickinduplexDNAistheabsenceofaphosphodiesterbondbetweentwoadjacentnucleotidesononestrand.3基因克隆中涉及的主要的核酸酶核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割DNA连接酶与DNA分子体外连接DNA聚合酶*DNA聚合酶I与核酸杂交探针的制备*大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记*T4DNA聚合酶与取代合成法标记DNA片段*依赖于R

9、NA的DNA聚合酶与互补DNA的合成DNA及RNA的修饰酶*末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾*T4多核苷酸激酶与DNA分子5末端的标记*碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用单链核酸内切酶*S1核酸酶与RNA分子定位*Bal31核酸酶与限制位点的确定Taq酶与PCR技术TaqDNA聚合酶是一种耐高温的酶有关Taq酶的基本情况，在上一节已经作了详细的讲解，本讲只涉及核酸内切限制酶和DNA连接酶，其余的各位自己看书。二、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割1简介与定义名称：核酸内切限制酶(Restrictionendonuclease)，又称限制酶(Restrictionenzyme)。在中文译文中，过去也

10、叫限制性核酸内切酶，我们应按国家自然科学名词审订委员会公布的统一译名，不再使用这个名称。定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。数量：到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。(Morethan800restrictionendonucleaseshavebeendiscoveredindifferentfacteialspecies.)(fromLehninger,P.866-7)2寄主控制的限制与修饰现象(1)限制与修饰20世纪50年代研究发现：大肠杆菌EcoliX型菌株，能够辨别在

11、该菌株上生长的和在Y型菌株上生长的噬菌体，而且还能阻止在Y型菌株上生长的噬菌体对它的成功感染。此处应先简介phage和感染问题，以及敏感菌株、抗性菌株概念。*1.WernerAber发现，核酸内切限制酶的生物功能是认别(recognize)和切割(cleave)外源的DNA(例如感染的病毒DNA)；因此我们称此类DNA受到了限制(restricted)。然而细胞自己的DNA则不会被切割，因为在它上面为此种限制酶识别的核苷酸序列已经被一种特异的DNA甲基化酶(aspecificDNAmethylase)甲基化了；因此我们称此类DNA受到了保护。T.-.-r.j.*i.fc.fc.*2.在细菌当中

12、有时候称这种核酸内切限制酶及其相应的甲其化酶为限制-修饰体系(restriction-modificationsystem)。(2)若干概念*1转染(Transfection)病毒DNA或RNA感染细胞的过程；真核细胞捕获外源DNA并通过掺入作用而获得新的遗传信息的过程。*2转化(Transformation)细菌的转化是指细胞捕获游离的DNA,并使此DNA编码的遗传信息组入细菌染色体成为永久遗传组成部分；正常的真核细胞由于受到致瘤病毒的感染而转变成恶性细胞的过程，也称为转化。目前认为，凡外源DNA导入细胞的过程都可统称为转化。*3转导(transduction)以病毒为载体(对细菌而言，这种

13、载体则是噬菌体)把遗传物质从一种细胞转移到另一种细胞的过程。*4转位(transposition)遗传因子从基因组的一个位置转移到另一个位置的变化过程。*5转录(transcription)以DNA为模板合成RNA的过程。在这种过程中，DNA链上的遗传信息被抄录成RNA分子上的遗传信息。*6转译(Translation)包含在mRNA分子上的以核苷酸顺序形式排列的遗传密码，转变成蛋白质多肽链中氨基酸顺序的生化过程。转译通常也叫做蛋白质合成。(3)限制与修饰现象的解释：p(X)：表示在EcolX菌株上生长过的噬菌体UK)：表示在EcolK菌株上生长过的噬菌体用九(K)噬菌体感染大肠杆菌B株，形成

14、噬菌斑的效率就很低，其效价比在K菌株上生长的九(K)的效价要低几个数量级。我们说九噬菌体受到了B菌株的限制。但在这些稀有的由九(B)形成的噬菌斑中的噬菌体群体，贝g已经发生了某些变化。用这些变化了的X(B)phage再感染B菌株，它们就可以在B株上有效地生长。修饰定义：如此由第二个寄主细菌(大肠杆菌B株)赋予九噬菌体的这种非遗传变化，使得它再感染时能够有效地生长，而没有再次受到限制的现象称为修饰(Modification)。*因为不论是Restriction还是Modification,都是由寄主控制的，因此我们统称之为寄主控制的限制与修饰。限制与修饰现象的分子机理寄主控制的限制与修饰现象的分

15、子生物学研究发现：*在大肠杆菌B菌株中含有一种核酸内切限制酶，特称EcoB核酸酶这是一种作用位点特异的核酸酶，它只能在一种特定的碱基序列内切割DNA分子的两条链(识别序列)。*(K)噬菌体含有这种序列，所以当它的DNA注入E.coliB I 菌株时，便在这种酶的作用下降解掉。*但有一种位点特异的甲基化酶（EcoB甲基化酶）能使DNA序列上的腺嘌呤甲基化，这样的DNA序列可以抗御EcoB核酸酶的破坏。*当九（K）感染B菌株时，在庞大的被感染的细胞群体中，会有少量的亲本phageDNA分子在其被限制之前就已经发生了甲基化作用。由这种DNA而来的所有子代DNA分子中，都有一条链是甲基化的，因此新合成

16、的链也将迅速地甲基化，从而限制作用也就被阻止了。这样就产生出少量的具有B菌株修饰的噬菌体UB）群体。EcoB核酸酶I降解外源DNAIEcoB甲基化酶的修饰作用I甲基化的DNA可以EcoB核酸酶的降解作用产生出少量的具有B菌株修饰的MB)群体寄主控制的限制与修饰的生物学作用第一，保护自身的DNA不受限制第二，破坏外源DNA使之迅速降解3核酸内切限制酶的类型II型酶II型酶(见表3-2)皿型酶(1)I型核酸内切限制酶*1.1968年M.MeselsonandR.Yuan的工作介释：未修饰的九phageDNA用H3标记A修饰的入phageDNA用32P标记B用此A+B混合物同分部的细胞提取物一道温育

17、蔗糖梯度沉降法分析DNA混合物，结果未修饰的DNA降解了-修饰的DNA不降解f这样的结果表明存在核酸内切限制酶活性，于是这种酶被命名为I型酶。*2I型核酸内切限制酶的两个代表EcoK从大肠杆菌K株中分离出来的EcoB从大肠杆菌B株中分离出来的*3I型和III型核酸内切限制酶的缺点这I型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。远距离随机切割I型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。远距离定点切割I型核酸内切限制酶和III型核酸内切限制酶，

18、在切割反应过程中，都会沿着DNA分子移动，因此是一种需要能量的过程。需要能量的反应dI型和I型核酸内切限制酶，一般（通常）都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，又具有甲基化酶活性。内切酶活性和甲基化酶活性II型核酸内切限制酶II型核酸内切限制酶最早是由H.Smith分离的，它的反应作用不需要ATP,比较简单，而且是在所识别的序列内部切割DNA分子。*1II型核酸内切限制酶的发现首先发现II型核酸内切限制酶的科学家是H.O.SmithandKWWilcox(1970)，以及TJKellyandHOSmith(1970)。他们从流感嗜血菌Rd株中分离出来的限制酶，是迄今公认的一种II型核酸内

19、切限制酶的代表。4.H型核酸内切限制酶的特点(1)基本特点：在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA分子形成链的断裂；识别序列2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；单链切割部位因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子ATP，但需加入Mg+离子,而且是从其识别序列内部切割DNA分子在结构上是一种单一的成分，即与I型III型酶不同，不具有多种亚基成分；(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。绝大多数II型核酸内切限制酶都能够识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷

20、酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAATTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。(4)平末端与粘性末端由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成具平末端的DNA片段。Bluntends两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成一一具粘性末端的DNA片段。Cohesiveends3，G-G-C-G-C-C-5个对称轴粘性末端概念(定义)：*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。*有两种不同类型的核

21、酸内切限制酶都可以产生粘性末端，例如APstI酶形成具3，-OH单链延伸的粘性末端55-CTGCAG-33-GACGTC-5TB.EcoRI酶形成具5-P单链延伸的粘性末端55-GAATTC-3i-.-.-=.135-CTTAAG-5(4)限制酶的识别序列与切割频率具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。(5)同裂酶(isoschizomers)识

22、别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI就是一对同裂酶。同裂酶形成同样的末端。同尾酶(isocaudamers)一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。例如BamHI、Bglll、Sau3A等即是一组同尾酶。BamHIGGATCCBglIIAgatctSau3AGATC*同尾酶在基因克隆中有用处(举例说明)，但产生的重组体中原识别位点发生了变化。(7)识别多核苷酸序列的酶例如Hindll就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：5-CTPyPuAC-3其刊=嘧啶碱基C或T；Pu=表示嘌吟碱基A或G5核酸内切

23、限制酶的命名(1)命名原则a用属名的头一个字母和种名的头两个字母组成三个字母略语，表示寄主菌的物种名称，例如：大肠杆菌(Escherichiacoli)Eco流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)Hinb右下方标注表菌株或型，例如：EcoK如果限制与修饰是由病毒或质粒引起的则加标注EcoPI(表病毒引起的)Eco詁表质粒引起的)c如一种特殊寄主具几种限制-修饰体系，贝y以罗数表示。如HindIHindIIHindIII等。dddd所有限制酶都带有系统名称，如R.EcoRI,R.HindI限制酶M.Hinm修饰酶d(2)实际使用的名称：a略语中标注字母印刷不方便，现改为排成一行

24、，如HindmHindllldb上下文已经讲清楚的地方略去R或M6核酸内切限制酶对DNA的消化作用核酸内切限制酶同靶DNA识别序列之间的结合模型所谓核酸内切限制酶同靶子DNA识别序列之间的结合模型，即核酸内切限制酶同靶子序列之间的相互作用的问题目前已经弄清了许多种核酸内切限制酶同靶子序列之间的相互作用的精巧的分子细节：例如EcoRI核酸内切限制酶同其识别的DNA序列之间，是通过在其识别点上的嘌呤同在限制酶二聚体(dimericendonuclease)上的6个氨基酸(每个亚其都含有1个Glu和2个Arg残基)之间形成的12个氢链(hydrogenbonds)联系起来的。核酸内切限制酶对DNA分

25、子的局部消化从理论上讲，如果一条DNA分子上4种核苷酸(A、T、G、C)是完全等量的，同时其排列方式也是完全随机的，那么对于识别序列为6个碱基的核酸内切限制酶例如EcoRI、BamHI、PstI等，它们将平均每隔46=4096bp产生一次切割，形成等长的DNA片段，而对于识别序列为4个核苷酸碱基的核酸内切限制酶来说，典型的如Sau3A，它将平均每隔44=256bp产生一次切割。如果达到这样的水平的消化作用称为完全消化(completedigest)。局部消化问题(partialdigtest)：由于DNA分子中4种核苷酸碱基的排列并不是随机的，而且也不是等量的，因此实际上核酸内切限制酶对DNA

26、分子的消化作用的频率，是低于完全消化的频率(或者说所产生的DNA片段的分子量大小要大于完全消化的片段)。为满足实验需要，一种简单而有效的方法是，不让核酸内切限制酶对大量DNA酶切消化反应进行到完全，就可以得到平均片段大小得以增加的产物，此类不完全反应(incompletereaction),通常叫做局部消化(partialdigest)。(3)真核基因组DNA的酶切消化问题*1一旦某种真核基因组DNA被限制酶切割而片段消化之后，那么其中研究者感兴趣的目的片段就有可能通过琼脂糖凝胶电泳或高效液相层析(HPLC:high-performanceliquidchromatography,orhigh

27、-presureliquidchromatography高压液相层析)得到分离。*2但是用限制酶消化标准的哺乳动物基因组DNA,通常会产生出数量达(若干)105个或105-6个不同大小的DNA片段。因此要用琼脂糖凝胶电泳(Agarosegelelectrophoresis)或HPLC分离其中的某一特定的DNA片段，实际上是行不通的。而需要应用建立基因文库的办法才能达到。(4)DNA的酶切消化体系*1.核酸内切限制酶活性单位定义在标准的反应条件下，1小时内完全消化1聘九DNA所需要的核酸内切限制酶的用量称为1u酶。*2.反应体系的建立ReactionI(EcoRI)10XEcoRIbuffer2

28、九DNAsample3入（033吨）EcoRIenzymeU（10u）D.D.HO220gl120pl37Cfor1hr*3.加样顺序bufferfwaterfDNAfenzyme7影响限制酶活性的生物因子及操作条件(1)DNA的分子特性存在着许多可影响限制酶消化DNA所需限制酶用量的因素。a限制酶识别位点周围的碱基成分它对限制酶消化DNA速率的影响可高达25倍b特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。例如对KpnI限制酶而言，1pg九DNA中有006pmolesKpnI切点；而1聘Ad2DNA分子中则有036pmoles的KpnI切点。c完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性

29、DNA需消耗更多的限制酶。dDNA的甲基化程度限制酶识别序列中特定碱基的甲基化作用，会强烈地影响限制酶的作用活性。因为核酸内切限制酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。通常大肠杆菌中分离的plasmidDNA都混有两种甲基化酶：dam-催化GATC序列中腺嘌呤甲基化dem-催化CCA/TGG序列中胞嘧啶甲基化为了避免发生甲基化作用，在基因克隆中使用的是失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA。*由于上述种种原因，对于不同来源的DNA样品，用同一种限制酶作完全的酶切消化反应，所需的限制酶单位是互不相同的；对于同一种DNA样品，用不同的限制酶作完全酶切消化，其酶的用量单位也是彼此不同的。完全切割不同

30、来源的DNA样品所需的限制酶单位限制酶DNA样品来源pBR322九DNASV-40174(RF)Adeno-2BamHI314-2EeoRI2.513-1Hind皿2.5110-3*真核基因(eudaryotiegenes)定义:所谓真核基因一般是指由真核细胞核基因组编码的基因，以及感染的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的全部基因。而由线粒体和叶绿体细胞器基因组编码的基因则不属于真核基因。（2）酶切消化反应温度DNA消化反应的温度是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。a最适酶切消化温度不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。有的如EcoRI等最适的温度是37C,大多数的限制酶的最适消

31、化温度都是37C；有的限制酶最适消化温度低于37C，如SmaI是25C；有的限制酶最适消化温度高于37C,如BstEII是60C。酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活。b限制酶的星号活力限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变（变更）的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列（识别位点）的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。星号活力会干扰实验结果，操作中要特别注意。例如正常的EcoRI其正常的识别序列是GAATTC,而EcoRI*的识别序列则是AATT。c产生星号活力的因素：酶单位数/DNA比值过高，超过10u/gDNA，就会产生星号

32、活力；甘油浓度过高(超过5%)；二价离子的改变，如果反应体系的Mg+2被Mn+2、Cu+2、Zn+2、Co+2代替，EcoRI和Hind皿等均会出现星号活力；低离子强度v25mmol/L；高pH值(8)有机溶剂，如DMSO,乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺,二甲基甲酰胺等。(3)DNA纯度酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性。因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响，这是因为DNA制剂的污染物（诸多杂质分子）诸如：蛋白质分子、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、高盐分子、以及甘油（gyceral）、DMSO（二甲基亚砜）等。特别容易受这些污染物影响的核酸内切限制酶有：EcoRI、B

33、amHI、KpnI、Sau3A、SalI、HhaI、PstI、SctI、DdeI。（4）影响限制酶活性的实验操作条件提高限制酶对低纯度DNA消化效率的办法：a增加限制酶用量一一10u/ggDNAb扩大反应体系一一使抑制因素被相对稀释c适当延长保温时间在限制酶的贮藏缓冲液中，加有50%的甘油作为防冻剂，一般要求在酶切反应体系中，甘油浓度应在4%以内，有的公司要求在2%以内。所以在20皿反应体系最多不得加入2皿的限制酶贮藏液。为了使反应体系中酶的活性达到最佳值的办法人们不要期望通过延长消化时间（即保温时间超过1小时）来弥补加入反应体系酶量的减少。要使酶切反应体系中限制酶的活性达到最佳，其办法是：a

34、在酶切反应体系中加DNAae-free的BSA（牛血清白蛋白）（其用量大约是100pg/ml）或是明胶（gelatin）,以使限制酶保持最大的稳定性，尤其是在长时间保温消化的情况下,更是必要。BSA=bovineserumalbuminb测定每种限制酶保持活性的时间长度。限制酶贮藏液，经过含有nuclease-freeBSA的特定的贮藏缓冲液稀释之后,限制酶的稳定性便会随之下降。因此,浓缩的限制酶贮藏液,最好在临用之前稀释,其数量最好是可供用少数几天即可。实验观察表明，当反应体系中DNA浓度超过1g/50gl时，需要增加限制酶的活性（用量）,因此在实验中,有必要根据实际情况,预先测定一下,1u

35、的限制酶到底能够切割多少pg的DNA制品。限制酶及DNA片段比较容易吸附（粘着）在未经硅油处理的玻璃器皿上,因此,我们建议在限制酶反应的全过程都使用塑料器皿或是用硅油处理过的玻璃器皿（siliconizedglassware）。此外在反应体系中掺和BSA可使限制酶活性稳定，并能够避免大分子对玻璃器皿的非特异吸附。所有的玻璃器皿均应经过高压无菌消毒，所有的反应缓冲液均应使用玻璃重蒸水(glassdistilledwater)和酶级纯试剂(enzyme-gradereagents)。要尽量避免DNA样品的冻-融次数。DNA制剂不显著改变反应混合物中的pH值和盐环境所用的DNA样品应该不含有重金属离

36、子，因为它们会抑制限制酶的活性。当用多种限制酶消化同一种特定的DNA,将所有的酶掺合在同一个反应混合物中，有可能出现抑制现象。遇到这种情况，要考虑作了第一种酶切消化之后，抽提限制的DNA，而后再行第二种酶的消化。三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接1引言目前已经知道有四种方法可以在体外将DNA片段连接起来：a用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来b用T4DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来c先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用DNA连接酶将之连接起来。d先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，然后再用DNA连接酶将之连接起来

37、。上述所有这些方法都涉及DNA连接酶。2DNA连接酶(DNAligase)定义：利用ATP分子中的Y-磷酸基团为能量，通过催化两条并排DNA链的5，-磷酸基团和3-羟基之间，形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的特异的核酸酶。连接条件：a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(P)，才能发挥其连接作用；b由于在-OH和-P基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程(反应)，因此需要能源分子的存在才能实现连接反应。在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是：NAD+烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(氧化型)在动物细胞和噬菌体中，

38、连接酶催化的连接能源是：ATP腺苷三磷酸(3)最佳连接温度理论上连接酶体外最佳连接温度是37C,但在此温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般经验认为是415C比较合适。(4)影响连接反应的因素ATP浓度一一建议分两次加入反应混合物连接酶浓度连接平末端DNA片段，需12u连接粘性末端DNA片段，需0.1u即可反应时间I参阅本书P316反应温度.插入片段与载体分子间的摩尔比值3粘性末端DNA片段的连接(1)过程T4DNA连接酶连接具粘性末端的DNA片段分子I转化到受体细胞使缺口(Nick)封闭I转化子筛选碱性磷酸酶处理碱性磷酸酶

39、具脱磷酸的功能，因此经它处理之后，可使5，-P脱去，从而阻止线性的质粒DNA发生自身再环化作用，达到提高重组率和转化率之目的。有两种碱性磷酸酶：BAP细菌碱性磷酸酶cip小牛肠碱性磷酸酶CIP具有明显的优点，它在SDS中加热至68C就会完全失活；而BAp是热抗性，要终止其作用就很困难；CIP活性要比BAP高出1020倍,所以实验中一般使用CIP。*经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力，但仍能与具5，-P和3-OH的外源DNA片段重组，并在转化到受 I 体细胞后完成Nick的修复工作。4平末端片段的连接T4DNA连接酶连接法T4DNA连接酶与大肠杆菌DNA连接酶不同，它在具有A

40、TP和高浓度酶的条件下，亦可以连接平末端的DNA片段。同聚物加尾法原理：本法的核心是利用末端核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的39H基团上，而且不需要模板的存在。由于这种特性，所以当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的条件下，便能够构成由同一种核苷酸组成的尾巴，在典型的情况下，这种同聚物尾巴可长达100个核苷酸左右。程序：用头末端特异的核酸外切酶处理平末端DNAI从而形成具3-末端延伸的片段A和B对片段A和B分别加入dATP和dTTP以及共同的末端脱氧核苷酸转移酶I从而形成具poly(dA)和poly(dT)的A片段和B片段I混合退火，通过poly(dA)和

41、poly(dT)之间的互补配对，形成重组体分子I转化Ecoli并从中挑选重组体克隆*实际上加尾形成的poly(dA)和poly(dT)或poly(dG)和poly(dC)是不会严格等长，因此形成的重组分子仍会留有缺口或裂口，需要EcoliDNA聚合酶I或Klenow大片段酶去填补，然后用DNA连接酶合成最后磷酸二酯键并封闭裂口。衔接物连接法在构建重组体DNA分子过程中，若是用平末端法或是同聚物加尾法，所形成的重组体分子是无法用原来的限制酶作特异性切割，因此无法重新获得插入的DNA片段。*1.衔接物(linker)定义用化学法合成的一段由1012个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的平末

42、端的寡核苷酸片段。*2.连接步聚：图5-1a用化学法合成一段含BamHI限制位点的六聚体衔接物分子；b用T4DNA连接酶将BamHI衔接物连接到外源平末端DNA片段的两端；c经BamHI酶切消化之后，形成粘性末端；d这样的外源片段与经过同样限制酶切割消化的质粒载体重组；e转化到Ecoli受体细胞获得稳定的转化子。*3优点：a兼具同聚物加尾和粘性末端法的优点；b采用双衔接物(double-linkers)技术，可以实现外源DNA片段的定向克隆；c在双衔接物法中，是使用一对非同尾酶切割消化载体DNA分子，这样就避免了光外源DNA片段插入的线性空载体DNA分子的自身再环化问题；d可以根据需要设计合成

43、不同的衔接物，并可大量合成，以增加其在体外连接反应混合物中的浓度，从而提高了连接效率。(4)DNA接头连接法*1衔接物连接法的缺点：衔接物连接法的主要缺点是，如若待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所用衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端时，也会把克隆的外源DNA片段或基因切成不同的片段，从而为后续工作带来困难。当然遇到此种情况时可改用其它类型的衔接物，但在克隆的外源基因分子量较大时，往往难以做到恰当的选择。*2.DNA接头定义：是由著名分子生物学家、美国康奈尔大学生化分子生物学系吴瑞博士于1978年发明的，它是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊

44、的双链寡核苷酸短片段。图5-2一种典型的DNA接头分子的结构及其彼此相连的效应(a)BamHI接头分子的结构；(b)两个BamHI接头分子连接形成的衔接物。*3使用DNA接头连接DNA片段的缺点：如上图5-2-b所示，处在同一反应体系中的BamHI接头分子之间粘性末端，会通过碱基配对，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，尤其是在高浓度接头环境中情况更盛。这样也得使用限制酶进行切割使重新产生粘性末端。于是也就存在着如同衔接物连接一样的缺点。图5-3具异常的5，-OH粘性末端结构的BamHI接头的连接机理合成的BamHI接头分子同外源DNA片段连接。这个接头的粘性末端具异常的5，-OH基团，因此不会自我多聚化。用多核苷酸激酶及ATP等处理，使连接在外源DNA片段上的接头分子和5