二代测序(NGS)实验方案和应用

1、这里为您介绍二代测序的相干流程和利用.之杨若古兰创作随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展.这些新的测序平台答应进行高通量测序，具有广泛的利用：全基因组从头测序或者重测序目标序列重测序转录组分析微生物组研讨基因调控研讨NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、精确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差别 .从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器 .台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR样，本人进行测序.这些仪器

2、可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的利用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测罕见的突变，或者检测多样样本中（比方癌症样本）中的突变. 目前，这些仪器的通量在10Mb 到 7.5 Gb 之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步添加 .高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研讨，每次测序能测定600 Gb 的序列.一些如许的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度绝对较短，这对于高反复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为成绩.与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp）,但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多.还有一些测序能力位于两 者之

3、间的仪器（ 800 bp ， 700 Mb） .是以，利用决定了哪一种仪器是最合适的 .有一种新的方法被称作“纳米孔测序” . 这类技术中，根据一个 DNA 链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所惹起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基.这理论上可以仅用一步就测序一个完好的染色体，而不须要生成新的 DNA 链.DNA 测序二代 DNA 测序的工作流程如下：DNA 样本制备文库构建和验证文库分子大规模平行克隆扩增测序二代测序 DNA 样本的质量控制首先，评价基因组DNA 的质量是非常须要的（完好性和纯度） .凝胶电泳法基因组 DNA 的完好性和大小，可以用惯例或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳（PFGE）

4、来检测 惯例的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的 DNA 分子在凝胶中挪动的时候，实质上是用一种与尺寸有关的方式一路挪动的 .但是，它仍然能够提供完好性（大小范围）和纯度（ RNA 净化物在凝胶底部构成脱尾条带)方面的无效信息.是以，它仍然是评价基因组DNA 质量的无效方法之一.注： RNA 净化会导致DNA 浓度高估，而且按捺一些下流步调.如果能肯定有RNA 净化，则可使用去DNase 的 RNaseI 处理样本 .分光光度测定法分光光度仪在260 nm 和 280 nm 处读数的比例(A260/ A280)可以用来估计DNA 绝对于一些接收紫外光的杂质(比方蛋白)的纯度.纯净的DNA的A2

5、60/A280比例大约为1.7-1.9.注：想要获得精确的 A260/A280 值，须要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比方, 10 mM Tris?Cl, pH7.5).第二个步调是测定基因组DNA 的浓度 .分光光度法DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定.Nanodrop 目前被广泛使用，因为它须要的样本量少（1以l）,而且使用方便（不须要比色皿为了确保结果的可靠性，读数应当在0.1 到 1.0之间 .注：吸光度测定不克不及区别 DNA 和 RNA.RNA 净化物会导致DNA浓度高估.但是，纯净RNA的A26o/A280比值在2.0摆布，而纯净的 DNA

6、 大约为1.8.是以，如果这个值为1.95，那么说明样本里面有RNA 杂质 .注：苯酚在270- 275 nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于 DNA. 是以苯酚能提高样本在260 nm 附近的吸光度，从而导致高估DNA 的产量和纯度.荧光法荧光法使用荧光染料测定DNA 的浓度，具有特异性和灵敏性.Hoechst 33258结合到DNA 上后，能增大 458 nm波长附近的发光强度，除此以外，也能够使用一些更加灵敏的荧光染料，比方 PicoGreen 染料 .基于 PicoGreen 染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10， 000倍，而比使用 Hoechst33258染料的方法至多灵敏4

7、00倍.和紫外吸光光度法分歧，PicoGreen 实验对双链DNA 的选择性要远高于 RNA 和单链DNA.DNA 尺度品和样本与荧光染料混合，而且使用荧光计检测将样本的测定结果与尺度品的测定结果比拟较，以确定DNA 的浓度 .Real-time PCR可以使用real-time PCR技术来测定DNA样本的数量和质量多重 PCR 技术使用引物集在多个位点扩增分歧大小的片段，是检测 DNA 损伤和片段化的无效质控手段.此类技术试验专门测定可经 PCR 扩增，适于二代测序的 DNA 分子 .上 述提到的这些惯例方法，通常不克不及测定的样本中扩增得到的 DNA 的量，或者会高估了 DNA 的量 .

8、与它们比拟，real-time PCR更加适用于猜测 DNA样本是否适合于二代测 序.文库制备对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液 PCR 方法，对文库中的 DNA 片段进行克隆扩增，以发生足够拷贝数量的测序模板非常须要 .通过将平台特异性的适配子与感爱好的 DNA 源（比方基因组DNA 、双链cDNA 或者 PCR 扩增子等所发生的 DNA 片段）退火，得到片段文库 .适配子序列的存在，使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增.是以，这类方法不须要像传统的方法那样，在微生物两头体中，对基因组片段进行微生物克隆 .另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点

9、.通常情况下，一个惯例的 DNA 文库构建方案包含四步：片段化 DNA对 DNA 片段进行末端修复连接适配子序列（不适用于单分子测序）对可选的文库进行扩增目前有四种方法用于发生基因组DNA 碎片：酶消化法、超声波法、喷雾法和水动力剪切法.这四种方法都可以用于文库构建，但是每一种方法都有其长处和局限性 .核酸内切酶消化的方法快速而且容易，但是难以精确的控制片段长度的分布.另外这类方法可能会对基因组DNA 的呈递引入偏倚另外三种技术使用物理的方法将DNA 的双链打断，这类断裂是随机的，是以能在文库中对DNA 进行无偏的呈递.可以使用琼脂糖凝胶电泳或者主动化的 DNA 分析方法，对DNA 片段的尺寸

10、分布进行控制片段化 DNA 以后，须要将DNA 修复，发生5 磷酸化的 TOC o 1-5 h z 平末端 DNA ，以便能够和测序平台特异性的适配子相连接.文库构建的效力直接依附于 DNA 末端修复的效力和精确性末端修复混合溶液将5 或者3 的粘性末端转酿成5 磷酸化的平末端DNA. 在大多数情况下，末端修复通过T4DNA 聚合酶的5 3聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性完成.而 T4 多聚核苷酸激酶确保平末端的 DNA 片段5 端的磷酸化，以便进行后续的适配子连接.根据所使用的测序平台，平末端DNA 片段可以直接与适配子连接，或者须要在其片段的3 端添加一个单独的突出的腺苷酸 A ，以便

11、与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T 彼此配对 .通常情况下，使用 Klenow 片段（具有最低的 3 到5端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步调 .T4 DNA 连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连，然后使用回收反应或者根据DNA 的尺寸，选择性去除文库中未连接的适配子和适配子二聚体.大小筛选方法包含使用琼脂糖凝胶电泳分离，使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法.在连接过程中可能出现适配子的二聚体，它们会和与适配子连接的文库片段共同扩增，从而降低测序平台对真注释库片段测序的能力而且降低测序的质量，是以在测序之前，必须将它们从文库中除去 .一些测序平台

12、请求文库片段的长度分布在比较窄的范围内，以得到最好的结果，很多时候，这只能通过去除凝胶电泳上的响应的片段条带实现.这类方法也能够用来去除适配子二聚体.完成这一步调以后，应当对DNA 片段文库的质量进行检测，并进行定量检测.根据浓度和测叙文库的适配子设计，既可以直接浓缩溶液并用于测序，也能够对文库进行选择性扩增 .在文库扩增阶段，使用高保真的 DNA 聚合酶，合成完好的适配子序列，通过与PCR 引物的堆叠，用于后续的克隆扩增和与测序引物结合，或者提高 DNA 文库的产量.为了得到最好的文库扩增结果，请求DNA 聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚.文库质量评估方法，拜见 NGS 文库质控 .为了充

13、分利用测序能力，分歧样本得到的测叙文库可以放在一路，在同一轮实验中一同测序 .通过将 DNA 片段与具有分歧特征的适配子相连接，可以实现这一过程，即对于每一个样本使用分歧的短核苷酸序列作为适配子 .有一些其它的方法可以用于简化文库构建.有一种新方法使用转位酶 /DNA 的复合物进行体外转座，以便在同一个试管中同时将DNA 片段化并标识表记标帜.通过对所标识表记标帜的DNA片段进行无限次数的PCR扩增，可以构建完好的测叙文库，这节省了操纵步调和时间 .但是，使用体外转座构建的文库，与传统方法构建的文库比拟，具有更高的序列偏倚.NGS 文库质控高质量的文库是成功进行第二代测序的关键.文库构建包含复

14、杂的步调，比方片段化样本、修复末端、将末端腺苷酰化、连接适配子和扩增文库.根据使用的平台和文库类型，这些步调也会发生变更.监控每一个步调非常须要，包含在片段化样本以后检查片段的尺寸，和连接适配子以后检查片段的大小和浓度.文库验证过程中，须要分析文库中片段的大小和数量，这是质控的最初步调 .评估文库中片段的大小琼脂糖和 PAGE 凝胶电泳是传统的检测片段大小的方法，它们比较耗时.比来，基于微流技术的电泳或者毛细管电泳愈来愈广泛的用于检测片段的大小和浓度.即买即用的芯片和胶盒省去了配置凝胶的步调，使用方便.它们具有更高的通量，而且省去了很多的手动操纵时间. 除此以外，它们的灵敏度更高（对于检测的限

15、制更少），而且能完好主动化的获取数据和输出电子化的数据材料.这些仪器能同时检测片段的大小和浓度 .测定文库中的片段数量分光光度法和荧光法拜见分光光度法和荧光法电泳设备如前所述，基于微流技术的电泳和毛细管电泳除了提供片段大小的信息以外，还提供了定量检测数据.但是，电泳、分光光度法和荧光法的一个共同的局限性是，都只检测总的核苷酸的浓度，而非与适配子连接的分子的浓度.Real-time PCR将适配子连接到文库分子的两端，使得可以在平行的 PCR扩增步调中扩增上百万个独立的DNA分子（乳液PCR或者桥式PCR） .在有些仪器中，乳液PCR 可以将一个DNA分子扩增到数百万个不异序列的拷贝，并全都结合

16、在同一个珠子上.在另一种平台上，桥式PCR能够将一个DNA分子转酿成一个包含不异序列的多个拷贝的 DNA 簇 .是以，两端连接了适配子的扩增以后的分子，决定了乳液PCR 中模板和珠子的比例和桥式 PCR 中发生的最好DNA 簇 .对扩增后的文库中的分子进行精确的定量检测，对于确保片段的质量和高效的获得数据是非常次要的 .低估扩增文库中的分子数量，会导致混杂的旌旗灯号和难以解析的数据；相反地，高估分子的数量会降低结合模板的珠子或者DNA 簇的产量，而且没有充分利用测序能力 .Real-time PCR能够特异性的定量检测两端结合有适配子的DNA 分子，是以能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量

17、检测.Real-time PCR的灵敏性非常高，可以对浓度非常低的文库分子进行定量检测，即使其浓度低于传统方法可以检测的阈值.是以，这类方法能尽量减少对文库的扩增，降低可能的偏倚用于决对定量检测的数字 PCR数字 PCR 能够对二代测序的文库进行绝对定量检测，而不须要尺度品 .这个技术对文库进行无限的浓缩，并进行大量独立的 PCR 反应；是以，大多数反应没有模板，得到阴性的结果.一个单独的阳性 PCR反应统计为一个单独的模板分子.通过统计所有阳性PCR 的数量，能够确定文库分子的绝对数目 .数字 PCR 的次要长处在于：单分子的敏感性与 PCR 扩增的效力有关，因为成功的扩增被统计为一个分子，

18、而与终极产品的数量有关但是，这类技术须要特殊的仪器，而且花费较高，是以尚未广泛用于文库定量检测 .宏基因组学 MetagenomicsDNA 测序的利用领域之一是宏基因组领域，即从环境样本. 宏基因组学是指一个 环境样本中所包含的所有微生物基因组的功能和序列分析 .这个词汇起源于“ meta ”（在这里指对于基因多样性的零碎性理解）和“ genomics ”（对一个物种的遗传物资的综合分 析）宏基因组不是一个新的学科，但因为二代测序技术所带了的诸多可能性，宏基因组的利用经历了巨大的提升 .据估计，微生物中仅有1%摆布是可培养的，是以宏基因组学的研讨能极大的拓展我们对于环境的认识 .很多年以来，

19、“宏基因组”这个词汇仅与环境样本的分析有关，比方，分析从极端的生存环境下分离得到的 DNA ，以便发现能用于工业的新的生物催化剂 .但是，通量的极大提高，和所花费的费用和时间的降低，将这个领域的利用扩展到了很多其他方面.宏基因组学可分成几个领域，包含：病理基因组学 / 感染基因组学微生物组分析环境宏基因组学注：这其实不是全面的分类，研讨者可以选择其他的分类尺度 .病理基因组学 / 感染基因组学和疾病的诊断相干，用于确定有疾病症状的患者体内未知的病原体.这通常是极具挑战性的过程，因为微生物的数量可能非常少(每毫升血液中大概有1 -10个细胞).与之相反，微生物组分析则涉及到数量巨大的微生物，比方

20、口腔或者直肠拭子中的微生物.此时，我们的目标是分析这些菌群的构成 .考虑到人体仅包含1% 的人类细胞而其它99%都是微生物细胞，微生物组分析在将来的诊断技术中有潜在的巨大利用 .更多细节，请见人类微生物组工程().环境宏基因组学的目标除了包含传统的寻觅新的生物催化剂以外，还包含研讨和鉴定栖息环境.从理论上来讲，环境宏基因组学有两种分歧的研讨方法：全基因组分析：对所有存在的 DNA 进行测序16S分析：仅对16S rRNA DNA进行测序第一种方法只是简单的对样本中存在的所有 DNA 进行测序 .这可以完好地描绘所有出现过的微生物，而且可能发现新的酶或者酶家族，和抗生素的抗性.另一方面，这类方法

21、须要较高的测序能力，因此，绝对于第二种方法，其通量较低而且花费较高.与此相干的进一步的方法正在研发.在宏基因组的利用中，通常须要能提供较高的片段长度的测序仪，这是因为通常没有参考序列可供参照 .对于 16SrRNA 分析而言，测序仪的读长须要覆盖全部区域（另请参照二代测序仪） .RNA 测序RNA 测序（RNA-seq ）是使用深度测序技术来研讨生物体转录组的方法.此方法在构建合适的文库以后，对样本中的RNA 直接测序，得到丰富的数据集以进行分析.这项技术的高灵敏度和高分辨率使得它成为研讨全部转录情形的有价值的工具 .数据的定量性和测序技术的高动态范围使得其对基因表达的分析具有高度的灵敏性.数

22、据的单个碱基的分辨率提供了关于单核甘酸多态性（SNP）、选择性剪接、外显子/内含子鸿沟、非翻译区及其它元件的具体信息 . 除此以外，RNA-seq 不须要事后晓得参考序列，这使得从头的转录组分析和新的变异体和突变体的检测成为可能 .RNA-seq 是研讨转录组的强大、革命性方法，但是使用这类技术须要非常细心以获得最高质量的数据.RNA-seq 中须要考虑的身分第一个须要考虑的身分是样本富集.总 RNA 通常只包含比例很少的编码RNA 或者功能 RNA ；样本中大部分RNA 是核糖体RNA （rRNA :大约占到了总 RNA的80- 90%）和较 少的转运RNA （tRNA）.为了防止将80-

23、90%的测序资本用在 反复的 rRNA 序列上，通常在测序之前，须要从样本中去除rRNA. 这通常可以通过特定的耗费 rRNA 实现，也能够通过使用寡聚胸腺嘧啶富集技术选择性富集Poly A 实现 .耗费rRNA 的方法可以同时保存编码RNA 和非编码 RNA （一项非常次要的研讨内容）的信息，而 Poly A 富集则仅保存了编码 mRNA.Poly A 富集可能会丢掉特定的 RNA 和具有高转换率的 RNA.有一些其他的方法可以防止rRNA 的影响，比方选择性降解大量转录物，或者不扩增 rRNA 的扩增技术.但是这些方法不像 rRNA 耗费或者 poly A 富集那么罕见，而且可能扭曲转录物

24、表征的正常水平.另外一个须要考虑的身分是要研讨的 RNA 的大小 .RNA 转录物跨越比较大的大小范围；与惯例的 RNA 分析比拟，关注小RNA的实验（比方 microRNA或者长度范围在15 -35bp 的 RNA ），须要特此外纯化和文库构建方案 .大多数其他大小的 RNA 片段可以同时测序（ RNA 测序的经常使用步调之一是将RNA分割成普通长度，比方200- 300 nt长度的片段） .RNA-seq 测序操纵步调一旦确定了移除核糖体的方法和要研讨的片段大小，就可以将 RNA 构建成一个文库.对于大多数测序仪器而言，这包含首先将 RNA 打碎成片段，其次通过逆转录方法构建双链cDNA.

25、 在后续的文库构建过程中，这些双链的 cDNA 被当作普通的基因组DNA 来对待.如果想要保存RNA 的直接信息（链型），必须使用点窜过的文库构建方案，比方将mRNA 与连接适配子直接相连，或者标识表记标帜 cDNA的一条链以便在测序之前移除.在进行测序计划过程中，须要考虑三个次要的因：测序深度、读长和是否使用双端测序数据.测序深度可以提供RNA转录物的丰度信息，而且较大的测序深度使得对于罕见转录物的检测更加灵敏.读长也很次要，因为较长的读段对于检测剪接事件更加灵敏（内含子-外显子鸿沟，外显子-外显子鸿沟）.双端测序数据能提供更多关于转录物结构的信息，特别是彼此分隔的较远的外显子.普通而言，从

26、头分析和寻觅新的结构变异请求较高的测序深度和读长，而且会得益于双端测序数据.典型的测序利用包含100- 200 M片段，长度为2 x 50- 100 bp.与之相反，表达分析得益于较高 的测序深度，但是读长和双端测序数据则对结果的改善感化较小.这方面利用的一个典型实验包含10- 30 M片段，读长为 1 x 35- 100 bp.基因调控研讨二代测序技术也是研讨基因调控收集的强无力的工具. 比方ChIP-seq技术（染色质免疫共沉淀测序）可以用于分析蛋白-DNA 的彼此感化.二代测序技术也能用于确定基因组的全局甲基化模式.ChIP-Seq染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是用于研讨转录因子和润色

27、组蛋白基因调控机制的强大、多功能方法.这类技术用于确定活细胞中染色质上那些与转录因子、共调节因子、润色组氨酸、染色质重塑蛋白或者其它的核因子彼此结合的区域全部操纵过程非常耗时，包含了很多步调和变量，每一个步调都须要研讨者根据本人的模型体系进行优化 .将细胞与甲醛交联以后，将染色质中共价相连的基因组DNA 和核因子复合物分离出来，然后经过超声波处理，剪切成可以处理的大小 .抗体与目标核蛋白特异性免疫共沉淀时，也将与这些核蛋白特异性结合的基因组DNA 也沉淀上去了 .去除化学交联并经过核酸纯化处理的这些 DNA 可用于测序、基于微阵列的基因组杂交或者PCR 扩增 .ChIP 与二代测序技术联用(C

28、hIP-Seq)可研讨与感爱好蛋白相结合的位点在基因组的范围内的分布.与微阵列分析(ChIP-Chip) 比拟， ChIP-Seq技术提供了较高的空间分辨率，动态范围和基因组覆盖度，因此它对于 DNA 结合位点的检测具有超等的灵敏度和精确度.另外，ChIP-Seq 技术通常只需很少的起始样本输入量，而且不须要杂交探针，具有较高的灵活性，任何测序过基因组的物种都可以使用这类方法进行研讨 .高效的ChIP-Seq过程须要优化几个关键的变量.首先，甲醛交联的温度和时间须要优化.如果蛋白和DNA 交联的过于紧密，则在测序之前没法将染色质无效地打碎成片段，而且去除交联也会碰到困难.通常情况下，最好以在3

29、7 C 下与1%的甲醛共培育10 分钟起始，然后在此基础上进一步优化有几种分歧的方法可以将染色质打成碎片，比方超声波和酶消化（比方使用微球菌核酸酶） .如果使用二代测序技术来分析免疫共沉淀的 DNA ，染色质碎片的大小应在大约100- 300核昔酸长度范围内，而且每一个测试零碎中（细胞的类型、组织的类型），将染色质打碎成片段的参数也须要严酷优化 .ChIP 实验的成功与否取决于所使用的抗体的量和特异性.最好选用能从多家抗体厂商处获得的，经过ChIP 实验验证的抗体 .为了确定抗体能特异性地沉淀目标蛋白，可以使用蛋白印迹技术检测核提取物.如果在结果中，仅能观察到一条特定大小的条带，则可认为该抗体

30、是特异性的.使用选定的抗体进行免疫共沉淀，然后通过蛋白印迹分析技术确定抗体是否能特异性的沉淀目标蛋白.如果如许的实验失败了，那么还可以将选定的抗体与培养的细胞进行免疫荧光试验.如果仅有细胞核显色，则说明抗体至多能特异性的识别一种位于细胞核内并可结合到 DNA 上面的蛋白 .根据目标蛋白的丰度，经过验证的抗体的量和用于免疫共沉淀的染色质的量必须经过优化，以便获得足够的 DNA 进行测序 .对于识别组蛋白和组蛋白润色的抗体而言，每一次免疫共沉淀反应大概须要100， 000 到 1 百万个细胞中的染色质 .如果转录因子与DNA 结合的动态性较高或者与组蛋白比拟，仅在无限的基因组位点上结合，那么实验就

31、须要更多的染色质.为防止多余的抗体与非目标蛋白和染色质的非特异性结合，同时包管能沉淀足够多的目标蛋白，每一次免疫共沉淀反应使用的抗体的数量也非常次要 .通常而言，1 - 10廊抗体即可得到合理的结果.可以用对照反应来比对ChIP 反应的特异性.在平行的ChIP反应中，使用同样数量的染色质，可以使用同型的对照抗体或者没有抗体的珠子用来对比抗体和珠子与蛋白和染色质的非特异性的结合.通过比较阴性对照样本和 ChIP 样本中在特定位点沉淀的DNA 的量，能计算这个位点的富集因子但是，在这类免疫共沉淀对照实验中得到的沉淀物的量通常很少，缺乏以提供足够的片段进行二代测序 .是以， ChIP-Seq实验通常使用输入对照样本作比对.在这类情况下，每个ChIP 反应中通常有1%交联而且打碎的染色质被用来去除交联而且与沉淀的样本一同纯化并进行后续的深度测序 .这使得我们可以比对因为打碎染色质所惹起的偏移，这些偏移表示在染色质的局部结构， DNA 扩增，测序，拷贝数量的 变更，和测定基因组区域的能力 在沉淀的 DNA 碎片去除交联和纯化以后，建议使用 realtime PCR技术确认与目标蛋白结合的基因组位点的回收和富集后果.通过比较输入对照组与 Ch