森林植物检疫检验

1、第五章 森林(snln)植物检疫检验森林植物检验检测实验室 样品和取样昆虫、螨类和杂草种子的检疫检验植物病原真菌的检疫检验植物病原细菌的检疫检验植物病毒(bngd)和植原体的检验检疫植物线虫的检验检疫植物检疫新技术复习思考题共四十一页检验技术应符合以下基本要求：灵敏度高，准确可靠(kko)，能检出低量有害生物；简单、快速、方便易行；要有标准化的操作规程，检验结果重复性好；安全，不会造成有害生物的扩散。共四十一页一、森林植物检验(jinyn)检测实验室国家级重点实验室；区域性中心(zhngxn)实验室；常规实验室建筑条件检疫实验室（检验室）-病、虫、草标本室预处理室消毒处理室人员条件林学、森林保

2、护或相关专业领域高级技术人才或复合型专业技术人才共四十一页仪器设备条件国家级重点实验室应具备显微成像系统、酶联检测仪等仪器设备-快速反应和应急能力地区性中心实验室应具备显微镜、解剖镜、普通冰箱、水浴箱（或温箱）、离心机和必要的摄像器材、消毒和污物处理等设备常规实验室应具备病、虫、杂草检验所需的基本设备，如放大镜、解剖镜、无菌操作台等实验室管理(gunl)资质(zzh)认定证书的有效期为3年。国家级实验室的资质认定，由国家认监委负责实施；地方级实验室的资质认定，由地方质检部门负责实施。共四十一页二、样品(yngpn)和取样样品管理制度抽取检验样品要给报检人签发采样凭证。在检疫过程中发现检疫性有害

3、生物和其它危险性病、虫的，必须保存样品，保存期至少3个月。对不易长期保存的样品，可根据具体情况缩短时间。样品要制成标本保存。标本要注明寄主、调入（出）地和发现时间；不易制成标本的被害状及现场，可摄制照片(zhopin)、录像片等存档备查。样品要有专人负责管理，保存期间要注意防潮、防虫，以免受损变质。根据样品种类登记造册，列明报检单位、货物名称、样品数量、取样时间、存放起止日期、检疫结果和最后处理意见。共四十一页取样应施检疫的森林植物及其产品包括：（1）林木种子、苗木和其它繁殖材料；（2）乔木、灌木、竹子等森林植物；（3）从疫情发生县运出的木材、竹材、根桩、枝条、树皮、藤条及其制品；（4）森林植

4、物的种子、苗木、接穗，以及用疫区木材、种子、苗木等为原材料制成的林产品；（5）花卉植物的种子、苗木、球茎、鳞茎(ln jn)、鲜切花、插花；（6）中药材；（7）可能被林业检疫性有害生物污染的其它林产品、包装材料和运输工具。共四十一页三、昆虫、螨类和杂草种子的检验(jinyn)检疫（一）昆虫的检验1.直接检验2.过筛检验筛选时间：手动筛选，左右摆动20次；在筛选振荡器上0.5 min。害虫含量（头/kg）= 样品中害虫头数（或卵粒数）/代表样品重量（g）1 000冻僵或休眠：害虫置于20-30 温箱内处理15-20 min3.隐蔽害虫的检验A染色检验-谷象、米象(m xin)、豆象类紫穗槐种子1

5、0 g放入铜纱网中，浸入1 %碘酒溶液中染色1-1.5 min，取出后移入0.5 %氢氧化钾或氢氧化钠溶液中处理30 s，然后用清水冲洗20-30 s，倒入白瓷盘用扩大镜仔细检查，凡在靠近种托处有一个直径1-2 mm黑色圆点的种粒，即为虫蛀的种粒共四十一页B比重检验-种实含虫率较低；线虫虫瘿、菌核和杂草籽食盐水、硝酸铵溶液种子与溶液的容积比以1:5为宜滞留时间：一般的1min，落叶松种子小蜂，10hC解剖检验D软X光机检验-稀有、珍贵种苗的检验检疫在暗室首先把放大纸或黑白文件反拍胶片按照需要的尺寸切好，装入黑纸袋中并做好标记，再把被检的种苗样品放在黑纸袋（放大纸或胶片的正面）上，置于国产HY-

6、35型或其它型号农用软X光机载物台上，调好焦距，打开电源，调好电压、电流和曝光时间，开机拍摄。在暗室把放大纸或胶片取出，用显影液显影，用酸性定影液定影，最后根据(gnj)照片上的害虫影像进行识别。种壳种仁连成一体呈白色者为健康饱满的种子；种壳轮廓清晰，种壳内呈暗灰色者为空粒种子；种壳轮廓清晰，种壳内暗灰色，在暗灰色的中央有一个白色幼虫影像者为被害种子；在种壳内暗灰色的中央有几个白色幼虫影像重叠在一起者为寄生性天敌的幼虫。共四十一页E诱器检验-产地、港口、货场等地诱捕器由诱集剂、诱芯和收捕器三部分组成。目前应用的诱集剂主要有信息(xnx)素和诱饵两类。诱芯是诱集剂的负载材料，由塑料、橡胶、脱脂棉

7、、海绵等材料制成。诱捕器的种类很多，常用的有船形、三角形、圆筒形等。共四十一页（二）螨类检验(jinyn)怕干、畏热、负趋光性1.分样器电热加温检验：厚度5mm左右，43-45，30min，盘下玻璃板上的螨类2.漂浮法快速分离检验共四十一页（三）杂草种子检验1.果实与种子外部形态鉴定(jindng)2.解剖鉴定3.幼苗鉴定 共四十一页四、植物病原真菌(zhnjn)的检验检疫直接检验染色检验洗涤检验保湿萌芽检验分离培养检验种子分部透明(tumng)生长检验共四十一页1.直接(zhji)检验适用范围：具明显症状的植物材料主要工具：放大镜或解剖镜，主要是利用(lyng)肉眼现场快速初检2.染色检验法

8、原理：染病的组织，或病原菌本身，经特殊的化学药品处理后，可带有特殊的颜色例如：马铃薯癌肿病（Synchytrium endobioticum）薯块上癌瘤不明显时，可做徒手切片，加1滴1的“藏花红”染色液，健康组织细胞壁呈亮红色，感病组织细胞壁呈暗红色。共四十一页3.洗涤(xd)检验法原理：种子表面常附着真菌孢子，将一定量的样品放入容器内，加一定量的无菌水，充分振荡，可使病菌孢子洗涤下来，而后离心后，可沉淀，镜检沉淀物可确定其种类和数量。主要仪器和试剂：振荡器、离心机、显微镜、0.1吐温溶液等主要试验流程(lichng)如下：共四十一页称取样品洗脱孢子（振荡）离心富集镜检计数1:1或1:2；振荡

9、(zhndng)5-10 min以2500-3000r/min低速(d s)离心10-15 minA视野推算法B血细胞计数板测定法孢子生活力测定共四十一页取一份样品（约100粒或5 g），按上述步骤所得的沉淀物，用0.5 ml蒸馏水悬浮后，用吸管吸取1滴悬浮液放在载玻片上。镜检至少观察5个玻片，每个玻片上检查10个视野的孢子数量，求出每个视野的平均孢子数。同时，算出每一视野的面积及整个盖玻片的面积，以及(yj)全玻片的视野数。再以视野数乘以每一视野上平均孢子数，再乘以0.5 ml水的滴数，即得100粒种子或5 g样品中的孢子总数，算出每粒种子或每克种子的带菌量。共四十一页影响检验结果的因素：种

10、子表面的病菌孢子不一定能完全洗涤下来；离心管内，悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜，管壁上也可能黏附孢子；将悬浮液滴于玻片时，由于孢子迅速沉淀，造成一些视野间孢子分布极不均匀；操作不够严格，造成人为(rnwi)误差。共四十一页4.保湿萌芽(mngy)检验原理：种子携带的真菌，无论外表黏附的还是潜伏种子内的，在种子萌发阶段即可开始(kish)侵染，甚至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。主要仪器及试剂：吸水纸、沙土、冰箱、培养箱等。主要包括：保湿培养检验、沙土萌芽和土内萌芽检验等三种方法，其中保湿培养检验法是国内外最常用的一种方法。共四十一页吸水纸法-种传半知菌无菌吸水纸（3层）灭菌(mi j

11、n)培养皿 吸水11.5cm培养(piyng)、观察12h光照黑暗交替恒温所观察到的结果示意图如下共四十一页共四十一页5.分离(fnl)培养检测常规(chnggu)植物病理学方法马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、麦芽浸汁琼脂培养基（MEA）、燕麦粉琼脂培养基（OMA）常用接种方法:拌种接种;浸种接种;花期接种；整株喷雾接种共四十一页6.种子分部(fn b)透明检验用化学方法或机械剥离方法分解种子，分别收集需要检查的胚或种皮等部位(bwi)，经脱水和组织透明处理后，镜检菌丝体和卵孢子。以检测大麦种子传带的散黑穗病菌为例，其操作过程如下：先将种子在加有锥虫蓝的5氢氧化钠溶液中浸泡22h，然后用60

12、-65的热水冲击或小心搅动，使种胚分离，并用孔径分别为3.5 mm、2.0 mm和1.0 mm三层套筛收集种胚。种胚用95乙醇脱水2 min，再转移到装有乳酸酚和水（3:1）混合液的漏斗中，胚漂浮在上部，夹杂的种子残屑沉在底部并通过连在漏斗下端的胶管排出。纯净的种胚用乳酸酚煮沸透明2 min，冷却后用实体显微镜检查并计数含有散黑穗菌菌丝体的种胚，计算带菌率。共四十一页7.生长(shngzhng)检验植物繁殖材料的入境后隔离检疫。供试材料种植在经过高压蒸汽灭菌处理或干热灭菌的土壤、沙砾、石英砂或各种人工基质中，在隔离场所和适宜(shy)条件下栽培，根据幼苗和成株的症状鉴定。共四十一页五、植物(z

13、hw)病原真菌的检验检疫1.直接检验(jinyn)2.分离培养法3.噬菌体检验4.生理生化测定5.致病性测定6.过敏性反应测定7.血清学检验8.免疫吸附分离法共四十一页共四十一页2.分离(fnl)培养法种传细菌的提取浸种法；干磨法；湿磨法提取前注意选择已病变的种子，以0.1 升汞水进行表面消毒1-2 min，用灭菌水洗涤，再将此种子放于70 酒精中浸几分钟，然后放入盛有灭菌水的三角瓶中摇荡洗涤2-3次。块茎、块根细菌的分离在病健组织交界处割取较大的一块组织，用0.1 升汞水消毒1 min，然后用灭菌水冲洗3次，用灭过菌的刀挑取一小块组织（约(0.50.5l) mm3），放在预先(yxin)准备

14、的灭菌培养皿内的无菌水（约5 ml）中充分磨碎、搅匀，然后用铂圈取一环菌液，移入第二个培养皿内，搅匀。按此法顺序移至第五个灭菌培养皿中，从该皿中挑取菌液进行划线分离。共四十一页3.噬菌体检验(jinyn)增殖法 加入已知的专化噬菌体，经过一定时间的培养增殖，判断是否存在相对应的病原细菌。间接法 测定种子是否存在目标噬菌体，从而间接证明(zhngmng)是否带菌，此法较常用。共四十一页4.生理(shngl)生化测定将培养的细菌接种于特定(tdng)的培养基或检测管，通过产酸、产气、颜色变化等反应，或通过检测细菌的耐盐性、好氧或厌氧性、对碳、氮等化合物的利用和分解能力等进行鉴别。Biolog细菌自

15、动化鉴定系统是美国研制的一种专门用于细菌鉴定的专家系统，目前应用3.70数据库软件可鉴定567种革兰氏阴性菌（G-）和256种革兰氏阳性菌（G+）。共四十一页6.过敏性反应(fnyng)测定烟草是最常用的测定植物。注射针头由烟草叶片背面主脉附近插入表皮下，注入菌悬液。若为致病细菌，1-2d后，注射部位(bwi)变为褐色过敏性坏死斑块，叶组织变薄变褐，具黑褐色边缘。共四十一页7.血清学检验(jinyn)最常用的血清学方法有免疫电泳和免疫电镜、琼脂双扩散、酶联免疫吸附法（ELISA）等。传统的血清学方法还有：琼脂扩散法、试管沉淀法、凝集反应法、微量沉淀法等。应用最普遍的是酶联免疫吸附试验(shyn

16、)（ELISA）和免疫荧光抗体法。共四十一页酶联免疫吸附试验(shyn)（ELISA）共四十一页直接酶联法 先将待测抗原置于微量反应板凹孔中培育，在吸附抗原后洗涤，保留吸附孔壁的抗原，随后加入特异性酶标记抗体，经洗涤后保留与抗原相结合的酶标抗体，形成抗原抗体复合物，再加酶的底物形成有色产物，用肉眼定性判断或用分光光度计定量测定。间接酶联法 利用抗家兔或鸡球蛋白的山羊抗体与酶结合制备的酶标记抗体，只要制备出抗原的家兔特异抗血清，不需要再制备酶标记抗体就可用以检出抗原。国内多用辣根过氧化物酶标记。操作时先将待测抗原吸附于微量反应板孔壁上，培育一定时间(shjin)后洗涤，加入特异性抗血清，经培育和

17、洗涤后再加入羊抗兔酶标抗体，最后加入酶的底物，并及时观察结果。共四十一页8.免疫吸附分离法常用的免疫吸附分离(fnl)有：平皿免疫吸附评价测定法（petri dish immunosorption evaluation test）和免疫吸附稀释培养法（immunosorbent dilution plating，简称IDP）两种。共四十一页a用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油包被L形玻棒b用包被缓冲液（0.05 mol/ L碳酸缓冲液，pH 9.6）稀释抗血清，将包被有指甲油的玻棒放在抗血清中孵育，27 孵育1 h或于4 过夜。设置对照：正常血清和包被缓冲液。c用RT缓冲液（NaCl:2.0 g，

18、KCl:0.05 g，CaCl2:0.05 g，NaHCO3:0.25 g，KH2PO4:1.25 g，吐温20:1.00 ml，蒸馏水:1 000 ml，PH 7.4）淋洗玻棒3次，每次1 mind用RT缓冲液配置所测样品悬浮液，在样品液中，将包被有抗体的玻棒于27 下孵育1 h或4 过夜，以吸附目标细菌e将玻棒垂直放置，在包被有抗体区域上方2 cm处，用RT缓冲液轻轻滴洗玻棒f营养琼脂表面划线(hu xin)后培养，观察菌落。共四十一页六、植物(zhw)病毒和植原体的检验检疫1.生物学检测技术(jsh)a直接检验b生长检验c指示植物鉴定2.血清学检验技术3.物理方法检测a病毒形态的透射电镜

19、观察b荧光染色显微检验法4.分子生物学检测方法a分子杂交检测b聚合酶链式反应检测（PCR）5.植原体的检测自1985年首次制备了翠菊黄化植原体单克隆抗体以来，已有4种植原体单克隆抗体制备成功。核酸杂交和PCR方法是植原体快速、高效的分子检测和鉴定方法。共四十一页七、植物线虫的检验(jinyn)检疫1.直接检验适合检验植物组织内生活的线虫2.染色检验适于检验植物组织中的内寄生线虫烧杯中加入酸性品红乳酸酚溶液(rngy)，加热至沸腾，加入洗净的植物材料，透明染色1-3 min后取出用冷水冲洗，然后转移到培养皿中，加入乳酸酚溶液褪色，用解剖镜检查植物组织中有无染成红色的线虫。3.分离检验a改良贝尔曼

20、漏斗法基本装置是一个直径适当的漏斗，漏斗颈末端接一段乳胶管，用弹簧夹把管子夹住。b过筛检验法c漂浮分离法d浸泡浮力离心法共四十一页b过筛(u shi)检验法用于从大量土壤中分离各类线虫。土壤样品置于盆中，加入2-3倍的冷水，搅拌土壤并振碎土块过20目筛，土壤悬浮液流入第二个盆中并喷水洗涤筛上物，弃去第一个盆中和筛上的剩余物，第二个盆中的土壤悬浮液经l min沉淀按上法过150目筛，从筛子背面将筛中物冲洗到烧杯中盆中土壤悬浮液再继续(jx)过325目和500目筛。筛中物收集在烧杯中静置20-30 min，线虫沉集底部，弃去上清液，将沉集物转移到玻皿内镜检或吸取线虫鉴定。共四十一页c漂浮(pio f)分离法利用干燥的线虫胞囊能漂浮在水面的特性，分离土壤中的马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）和胞囊线虫，装置为芬威克罐。使用时先将漂浮筒注满水，并打湿16目筛和60目筛。风干的土壤经6 mm筛过筛并充分混匀后取200 g土样，放在16目筛内用水流(shuli)冲洗胞囊和草屑漂在水面并溢出，经簸箕状