植物的抗寒性检测

1、植物(zhw)的抗寒性检测主讲人员(rnyun)：小组代号：小组成员：共二十四页Company Logo实验(shyn)主要内容实验(shyn)背景实验目的实验原理实验步骤1234 注意事项5共二十四页Company Logo实验背景我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害，常常给越冬作物和果木造成严重(ynzhng)伤害。冻害由 0以下低温造成，冷害由 0以上低温引起，冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强弱决定(judng)其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而选育抗寒性强的果树

2、品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。本实验重点学习实验室间接鉴定植物抗寒性的检测方法。共二十四页Company Logo实验(shyn)目的Your Text hereYour Text hereYour Text here 1、了解(lioji)植物的抗寒性机制并掌握实验室间接鉴定抗寒性的检测方法。 2、掌握用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离 POD 同工酶的原理和技术。共二十四页Company Logo实验(shyn)原理 实验室间接鉴定(jindng)就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。 在一定低温范围内，植物

3、体内自由基的产生和清除之间基本上可以保持平衡。当温度持续下降时，活性氧自由基就会明显增加，清除剂含量降低，导致自由基积累，造成膜脂氧化。生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。共二十四页Company Logo实验(shyn)原理本实验采用(ciyng)同工酶分析测定法。同工酶带相对迁移率计算：Rf 酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带一般比抗寒性差的品种多 13 条，且随着温度下降变化缓慢。共二十四页Company Lo

4、go实验(shyn)步骤实验(shyn)步骤6、同工酶带相对迁移率计算1、材料处理 2、贮液的配制3、凝胶板的制备4、电泳5、染色共二十四页Company Logo一、材料(cilio)处理植物枝条（花朵），将采回的枝条剪成 40cm 左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗掉泥土、灰尘），再用蒸馏水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行(jnxng)蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的6 份，其中一份作为对照，其余每份作为一个低温处理，放于冰箱中（04）保存备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝条放于超低温冰箱低温处理，处理温度梯度为：CK（0），-20，-25，-30，-35，-40

5、。降温速度为 4/h，达到目的处理温度后维持 12h，然后逐步升温，升温速度亦为 4/h。花朵的处理温度梯度为：CK（0），-1，-3，-5，-6，-7，-8。共二十四页Company Logo二、贮液的配制(pizh)A30%Acr0.8%Bis 贮液B1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8）C1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）D电极(dinj)缓冲液E1%过硫酸铵溶液F溴酚蓝溶液贮液的详细配制共二十四页Company Logo三、凝胶板的制备(zhbi)分离胶的制备分离胶浓度多为 7%，按照表 53 进行配制。先用刻度吸管准确地吸取 30%Acr0.8%Bis 和 1M

6、 Tris-HCl（pH8.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压(jin y)抽气，除去溶液中气泡，抽气毕，再加入 1%过硫酸铵溶液和 TEMED，摇匀后，小心地将凝胶加入凝胶板模具内，上面加一水层，在 2530的地方进行聚胶，约 1h。共二十四页Company Logo表 53 贮 液不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）20ml30ml5%7%10%5%7%10%30%Acr0.8%Bis3.24.56.54.96.89.71M Tris-HCl pH8.816.315.013.024.322.419.51%过硫酸铵0.50.50.5400.80.8TEMED（为l）202020404040共二十

7、四页Company Logo隔层胶的配制按表 54 进行隔层胶的配制，用刻度吸管准确吸取 30%Acr0.8%Bis 和 1M Tris-HCl（pH6.8）于抽滤瓶中，用电动吸引器减压抽气，与此同时，吸去分离胶上层的水层，抽气毕，加入 1%过硫酸铵溶液和TEMED，立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速(xn s)加入蓖子），其中加一水层，约 1h 可聚合好。共二十四页Company Logo表 54贮 液不同配量及凝胶浓度所需贮液（ml）10ml20ml3%4%3%4%30%Acr0.8%Bis1.01.32.02.61M Tris-HCl pH6.81.01.32.02.6重蒸水7.77.115

8、.414.21%过硫酸铵0.30.30.60.6TEMED（为l）15153030共二十四页Company Logo加样装置好垂直(chuzh)板电泳槽，用 1%热琼脂封好缝隙。样品制备：每克鲜样加 3.0ml 0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.0），研磨，用纱布粗过滤。滤液离心：4000r/min，（02），取上清液作供试酶液。用 10 伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样器吸取样品液分别每管加入 50 微升。共二十四页Company Logo四、电泳(din yn)加样毕，注电极缓冲液入上、下电泳槽，在上槽中加入(jir)一滴溴酚蓝。接通电源，上槽为负极，下槽为正极。调节电流为 2 毫

9、安/厘米（2 毫安/管），在冰箱内进行。待溴酚蓝迁移至下端约 0.51cm 处停止电泳，约 2h。共二十四页Company Logo五、染色(rns)将脱下的凝胶，用去离子水冲洗凝胶板后，放入长方型白瓷盘中染色。A染色贮液配制 0.2M 醋酸钠溶液：称 2.8g 醋酸钠溶于 100ml 重蒸水中。 5mM 硫酸锰溶液：称取 0.168g 硫酸锰，溶于 200ml 重蒸水中。 联苯胺溶液：称 0.5g 联苯胺，溶于 10%冰醋酸 250ml 中。 愈创木酚溶液：称 1.35g 愈创木酚，溶于 250ml10%醋酸中。以上四种溶液放冰箱(bngxing)中长期备用。 0.12%H2O2：凝胶洗出后

10、才加。随配随用。共二十四页Company LogoB染色配比：20：2：5：8：5C染色将配好的染色液倒入白瓷盘内凝胶板上，37保温 30min，酶带呈紫红色。取出漂洗后，7%醋酸中保存。过氧化物(u yn hu w)酶同工酶显色 23d 更为清楚，在暗室用透光照相的方法效果较好。也可用280mm 波长下用光密度计扫描定量。共二十四页Company Logo六、同工酶带相对(xingdu)迁移率计算研究表明，过氧化物同工酶与植物抗寒性的关系极为密切，抗寒性强的品种的同工酶带，一般比抗寒性差的品种多 13 条，且随着(su zhe)温度下降变化缓慢。共二十四页Company Logo注意事项密封

11、条要封好，不能漏水；灌胶时用移液管，可以慢一点，并水平移动，防止凝胶不均匀，凝胶不会很快凝固，所以(suy)不用担心；灌胶时不能有气泡产生，否则会影响后面凝胶的效果。共二十四页Company LogoA30%Acr0.8%Bis 贮液：称取 30gAcr 和 0.8gBis，用 50ml 重蒸水加热溶解(rngji)，将溶液用定性滤纸过滤到 100ml 容量瓶内，定容后盛于棕色瓶中，于 0-4冰箱中保存。B1M Tris-HCl 缓冲液（pH 值 8.8）：称取 121.14gTris 用重蒸水溶解后倒入 1000ml容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 8.8，最终加水定容至 1000ml，然后

12、用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入 04冰箱保存。共二十四页Company LogoC1M Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）：称 12.114gTris 用重蒸水溶解(rngji)后倒入 100ml 容量瓶中，用浓盐酸调 pH 值至 6.8，最终加水定容至 100ml，然后用滤纸过滤，盛于棕色瓶中，放入 04冰箱保存。D电极缓冲液：称取 141.1g 甘氨酸和 30g Tris 用重蒸水加热溶解后倒入 1000ml 容量瓶中，加水定容至 1000ml。用时稀释 20 倍，调 pH 值至 8.3。共二十四页Company LogoE1%过硫酸铵溶液(rngy)：称 0.5g 过硫酸铵溶于 50ml 重蒸水中，放入 04冰箱，可保存一周。F溴酚蓝溶液：称 0.2g 溴酚兰溶于 100ml 重蒸水中，配成 0.2%。共二十四页Thank You !共二十四页内容摘要植物的抗寒性检测。育种者重要育种目标之一。1、了解植物的抗寒性机制并掌握实验室间接鉴定抗寒性的检测方法。2、掌握用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离 POD 同工酶的原理和技术。实验室间接鉴定就是(jish)根据作物某些生理生化指标