琼脂糖凝胶天然琼脂课件

1、DNA的琼脂糖凝胶电泳分子生物学基本技术三峡大学医学院生物化学教研室凝胶电泳凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。特点：1. 可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2. 操作方法简便，电泳速度快。3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4. 适用于生化、免疫等定性定量测定。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可

2、以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼脂琼脂糖琼脂糖是由琼脂中提取出来的，D-半乳糖和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。中性物质，不带电荷D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 琼脂糖凝胶的优点(1) 操作简单，电泳

3、速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。缺点：1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳

4、迁移率不相同；DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系 琼脂糖凝胶浓度/(%)可分辨的线性DNA大小范围/(kb)0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系在分子量相当的情况下，不同构型的DNA的移动速度次序如下：共价闭环DNA (covalently closed circular，简称cccDNA)直线DNA开环的双链环状DNA。 质粒同一种质粒，由于其构象不同，电泳时的迁移率也不同。常会出现两条或三条电泳带一条是超螺旋质粒DNA的

5、带，移动速度最快；另一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带（开环质粒DNA），移动速度最慢。有时因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化（线状质粒DNA），其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form质粒离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE）Tr

6、is-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）Tris（三羟甲基氨基甲烷）：是一种生物碱，常用于生物实验中配制各种pH值的缓冲液。1M的Tris溶液的pH值大约是1011。EDTA 可螯合二价阳离子，抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀，TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid），是一种有机化合物。它是一个六齿配体，可以螯合多种金属离子。抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。由于EDTA在水及酸中的溶解度很小，常用的为

7、其二钠盐，也简写为EDTA 。10TBE缓冲液的配制配方Tris 108克EDTA 9.3克硼酸 55克H2O至 1000mlpH应为8.08.2临用时用水稀至1TBE（10倍稀释）上样缓冲液 0.25溴酚兰；0.25二甲苯青；30甘油水溶液作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便胶浓度（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb 核酸电泳常用的指示剂： 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； 二甲苯青（ xylene cya

8、nol, Xc ），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015minEB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 核酸电泳的染色剂 由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DN

9、A的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用银染色银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide，Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 。聚丙烯酰胺的优点：(1) 凝胶透明，有弹性，机

10、械性能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。(3)对pH和温度变化较稳定。(4)几乎无电渗作用，样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。(7)分辨率高。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS是阴离子去污剂，化学名称十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate) 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使其均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。

11、 夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽中的经SDS处理的样品电源 垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。混合样品带孔胶 按分子大小分离电泳方向 电泳 小分子大分子染色方法 蛋白质染色 氨基黑10B：氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基与蛋白质反应形成复合盐，是最常见的蛋白质染料之一。考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝G250 银染色法 电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。 相对迁移率实验目的掌握琼

12、脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验器材和试剂实验器材：制胶模具，水平式电泳槽，电泳仪，微量移液器, 微波炉, 紫外透射仪或凝胶成像系统。样品： DNA分子量标准品，DNA样品试剂 琼脂

13、糖1电泳缓冲液（TBE）6上样缓冲液溴化乙锭(EB) ：10mg/ml 电泳仪电泳槽与制胶模具微波炉凝胶成像分析系统紫外透射仪实验操作操作步骤1. 准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：三角瓶内：1g琼脂糖 +100ml(1TBE) 煮胶溶解 冷却至60(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入1xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面。水平式电泳装置3. 加样将DNA样品（5ul）与6 上样缓冲液（1ul） 混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。 4. 电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳Agarose Gel Electrophoresis+5. 结果观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。注意事项1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，