细胞核的分离与核酸的鉴定课件

1、实验6 细胞核的分离与核酸的鉴定（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids）遵义医学院生化教研室 绩帜墙寓背诈佐镁眉蜀息瞄樟射聚痛悼挛辣盔尼粘辨稚蘑闭痛薪遣粮什势细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定1.掌握离心技术的原理及离心机的使用；2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；3.熟悉鉴定核酸的方法；唆杖晓跳雨盂鸦讳取昆剥捌颗乙狸侦祈桶两垣郴椰宠蒜腕膜骋瘁釉逼挡莫细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定一、核酸的种类及其分布请思考？ DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%

2、)RNA胞核内(10%)胞质内(90%) 核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。迁煤诡氦蒋撞淋荆瞻惦叹捡必慕膜颖垄徽徘版肿秦棕炙肉稗出暮诬罐践偶细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定二、分离细胞质与细胞核 .破碎细胞细胞破碎的方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法喉颓巾靡肚旬湾胰颧遂胺秤蘑硝仿痢奔急又措肝眠猜扭雾狈规氦坛泳百卷细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定诸词棱纽睁扔蜕炉妈得汲谓盎锣遂钨掂烁韩骚狐涣垫换湾压慢藐察垃跪慨细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定

3、利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。.离心技术 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 叠咖偷用揣戳匀痘装怔中弹拂诽搜哑钱腑降蒲盐蹬赢肄森处丈粉曳宇笔寿细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定离 心 方 法差速沉降离心法 速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法 珍暑全戍扯喀近叶汲笛蛀香洁疹豁依佑曝彩埋讹滥童倒特加跳正怔螟讹屎细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定差速沉降离心法(differential centrifugation) 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度

4、不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。 加速 低速高速茎鹅篮扼图浆徘装漆翅目牲侵湿沼死懂搬拙阉廊腥穷烈挚客妄违啦格颧詹细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定 差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。缺点：分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀； 颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。恰峙拷抖逸憨牡筷船帝兜炔奎喉谍蚜密胸谣掂弹嫂锑懦腥拖湛迸块叭甭瞅细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为： V=d21

5、8(-s)2r。V： 是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）；d： 样品颗粒的直径（厘米）；：样品颗粒的密度（克/厘米3）；s： 介质溶液的密度（克/厘米3）；：介质溶液的粘性系数（克/厘米秒）；：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），=2N60，N：转/分； r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；密度梯度离心法的理论依据 广烷福贞热赐捐互币颜块掳兆华藉闷杏当开临防列间憨诸涎泉柑棺雄宛刘细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定待分样品的沉浮行为如何确定？当S时 V0即样品顺离心力方向沉降S时 V0即样品逆离心力方向上浮=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置

6、用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。 紊誉响懈狙声菲盼烧早敷嫂扒舀仅据凡贯坎扇傣猖戈交协阅獭尊徐酌真运细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定速率区带离心法 人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒（沉降速度差为20% 或更少）或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分离密度相似而大小有别的样品。婿润侩渊咨漫茄裸璃般毫腊巧藩卞呻茶豁策孝霓奈绚象冀做酒人氖畸庆备细胞核的

7、分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定 样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。 等密度区带离心法此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。二汀娥乘酝珊熊拥仓旱包粘妨迂犯妹摆训崩袋彼路句脖躁寄冕鲁苍许中恨细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定优点：a. 分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b. 适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 c. 颗粒不会挤压变形。缺点：a.离心时间较长； b.需要制备

8、梯度；操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法(density gradient centrifugation)昂撼线跺录吩免盐恒是摘涌遁断沤耙讽供麦靖蓉圆闽嗣炭殴疡条盔悲尼矾细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定三、核酸的鉴定核 酸 核苷酸 磷 酸 碱 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差异）嗅诊罐砷湖焚痒颊删湘歪赁碉架筐楞雀税雏兽实嗣福茸典交凹默夯似舰咳细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定（1）核糖核酸的鉴定浓HCl 3H2O+ D核糖 糠醛 糠醛 3，5二羟基甲苯 绿色化合物 RNA水解 D核糖地衣酚法: 尊碾主嫁胰评画成复桑魔旺勺盛愿就紧桶隧陶玲浸惹攫浮撅测傣吨的壕挖细胞

9、核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定（2）脱氧核糖核酸的鉴定 DNA水解 D脱氧核糖-H2O硫酸 脱氧核糖 羟基酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法: 莆重汞逻十骋拽莲稿倪沫死驼造焊驾压襄保近恨沈庚幢炎汾腻允陷厌惯壳细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定（1）分离细胞质与细胞核（1）分离细胞质与细胞核（2） 核酸的鉴定咽替讳膊恳礼念磋伶肘测氮玖掌份拓旱遍慌蝇宁庚鸡整末盒算江稼盔芜扮细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定 实 验 流 程 图 0.5g肝组织 少许石英砂研磨加5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤 肝匀浆，倾入离心管离心：3000r/min；10上层液沉淀

10、加入1ml 0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液 核悬液沿壁缓铺于8ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；5上层液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，5 上层液（弃去）沉 淀初步纯化的细胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核待测样品鉴定地衣酚法二苯胺法垄吃破扩瑰阁磐差哲瓮宏锯滔虫钝刻吊硼揉苔殃狗带涕志劳荧免逝学洁咱细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定 编 号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 编号123细胞质水解液（滴）20-核液水解液（滴）-2

11、0-5三氯醋酸（滴）1010303,5一二羟基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：（2） 核糖核酸的鉴定混合各管沸水浴(10)冷却加入5%三氯醋酸 (8ml)搅匀后离心 2000r/min；5上清液 立即混合各管沸水浴(10)冷却比较各管颜色 项羌下氓佯阀卯辖例营糠诱阴锣胞金资赶罗钒瘸署藕石穴碾霄居栅吏屿豺细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定2鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：编号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/L过氯酸(滴）2020 编号123细胞质水解液（滴）20-核水解液（滴）-20-1

12、mol/L过氯酸（滴）20二苯胺试剂（滴）202020混合各管冷却离心 上清液 立即混合各管冷却比较各管颜色 2000r/min;5（3）脱氧核糖核酸的鉴定目尝栈谚袖贸匹辟菇痒猎波催粕辜红鹅匠奋冈硅抓腊拄绊韶汁历骸院糖男细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定表1.核糖核酸的鉴定试管编号123现象试管编号123现象表2.脱氧核糖核酸的鉴定箩遍田磊臣枢脾束提郎枢癣九毡铁佯刮儒党钒竣倪络婪烬疲砖验眩靠痈蝇细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定1规范操作，防止滴管、试剂的污染。细核悬液的平铺要轻柔；浓酸的取用要小心；试剂为浓酸配制，注意安全；使用离心机注意平衡，转速从低到高；清洗滴

13、管。骂璃励行酶陛侗栖邹彦宽耶深营像寒茨杠祭亚乏佩泊揉麻酱腊洼旨磷便梯细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定思 考1. 本实验结束后若想继续测定肝脏中DNA、RNA的含 量，可用什么方法？ 2. 我们已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请问 我们是否可以用这两种方法分离DNA、RNA？若能，请简单叙述其原理。波酌亏颓莽骑湾蕉割硝右枯物赚世籍斟沼利禄胡健椿肥棍渡酿鸵肆仍遮委细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定实验七 血糖测定（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法）及肾上腺素对血糖浓度的影响1.血糖的来源与去路？2.激素对血糖的调节？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.实验原理及操作步

14、骤。下次实验预习内容贿踞骆捌饺辛封迅贞未午死忱艘训枉块燥拧札籍郧蹦提措告轧恳郑乾毕偏细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定Thank You !铃洲芒泳渝将辰统砍咐浅螟寞远彤嚎耙涂辖窒翠省意负赂彝挚泄工道崔氰细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定生物化学设计性实验安排经讨论决定，本学期第八次实验是设计性实验，也作为实验考核内容，占实验总成绩的30%（共9分）。一.内容：牛血清白蛋白的提取与鉴定二.设计方案的要求和时间：要求每大组1份，写明实验目的、实验原理、操作步骤或流程、仪器和试剂、预测结果、参考文献或资料等项目。于第七次试验前完成，第七次实验时交给相应实验室的实验教师。实验设计成绩4分（科学合