第八章抗生素类药物分析

1、第八章抗生素类药物分析第一节概述抗生素的来源:多数抗生素生物合成(发酵)少数化学合成或者半合成1、抗生素类药物一般检查项目： 鉴别试验: 用化学法、物理化学法以 及生物学法来确认是哪种抗生素 毒性试验: 控制药品中的毒性物质 无菌试验: 检查药品中有无杂菌污染 热源试验: 控制药品中的致热物质 水分测定: 控制水分含量 溶液澄明度检查: 检查不溶性物质 溶液pH试验: 测定pH 降压试验: 检查有降压作用的杂质 效价测定: 有效成分测定 生物学法 物理化学法目前各国药典仍以生物学测定法为主。2、效价测定抗生素的效价测定方法有: (1) 生物学测定法 以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效

2、价标准优点：原理恰好与临床要求一致，更能 够确定抗生素效价。灵敏度高，需要样品量较小既适用较纯精制品,也适用于纯度 较差的产品 已知或新发现抗生素都能应用 同一类型的抗生素,不需要分离, 可一次测定它们的总效价。缺点 操作步骤多，测定时间较长 误差较大(2) 物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。 优点 操作简单、省时、方法准确 具有较高的专属性 缺点: 对于结构相似的抗生素，测定结果往往只能代表总的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效价，只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时，才能用于效价测定。 3、本章内容 -内酰胺类: 青霉素类头孢

3、菌素类氨基糖苷类:链霉素庆大霉素四环素类:第二节-内酰胺类抗生素的分析一、化学结构与性质 1、化学结构 青霉素类结构 青霉素类: 母核: 由-内酰胺环和氢化噻唑环 组成的双杂环。 6-APA 6-Aminopenicillanic Acid 侧链 : RCO- 苄青霉素（青霉素G）氨苄青霉素RR 头孢菌素类结构母核: -内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。 （7-ACA）7-Aminocephalospoanic Acid侧链RCO- 2、性质 青霉素类和头孢菌素类结构共同特点具有-内酰胺环。 酸性 有羧基，具有酸性 pKa值在之间 与碱成盐 如：青霉素G钠、青霉素G钾等 旋光性 有手性碳原子，

4、具有旋光性3个手性碳原子2个手性碳原子 紫外吸收 青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收 但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具 有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。 侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也 有吸收。像苄青霉素。头孢菌素类分子中有共轭体系（OCNCC）在260nm处有最大吸收。 -内酰胺环的不稳定性 干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定.不稳定的部分是-内酰胺环 -内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用。 二、鉴别试验1、羟肟酸铁反应 2、青霉素的各种盐的鉴别 3、硫酸及硫酸-甲醛反应 4、硫酸-变色

5、酸反应 5、紫外分光光度法及红外分光光度法 三、含量测定 原理 青霉素在稀碱性条件下,水解生成青霉 噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用 于含量测定。1、酸碱滴定法 方法() 水解前：将样品溶液的pH调至8（加NaOH液至显粉红色）() 水解：加入定过量的标准碱溶液，水浴加热使水解() 剩余滴定：水解后，过量的碱用酸标准液回滴定(至pH8，粉红色无色)以“青霉素钠”为例 ChP 90（2）空白试验： 不加样品，其余操作同上（1）主试验 讨论 () 溶剂 新沸过且用0.01M NaOH液中和的水 目的：消除水中酸性物质影响（如CO2） () 滴定前中和 消除能消耗碱的杂质影响（如一些酯 类杂质）

6、() 空白试验目的: 在加热水解过程中，有可能会吸收CO2，对测定有影响，所以要做空白试验校正。() 本法供试品用量较大，多用于效价高的供试品的测定2、碘量法 原理： 青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其 在碱性条件下水解生成的降解产物 青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的 碘量可以计算青霉素的含量。理论上:1mol青霉素8mol I原子;实际上: 1mol青霉素89mol I原子温度，放置时间，pH，浓度，碘过量程度，杂质多少等影响因素。 方法： 以“青霉素钠”为例，ChP 二部（1）主试验：（2）空白试验： 讨论：（1）溶液的pH值在左右 （2）温度：2426（3）放置时间：1520（4）空白试验

7、：做法与一般空白不同（加样品,不加碱水解,其他操作同样品）目的：消除样品中预先存在的降解产物（青霉噻唑酸）及其他耗碘杂质的影响（5）灵敏度高：因为1:8，所以供试液浓 度在10100g/ml即可测定3、汞量法 原理： 青霉素分子不与汞盐反应，但其降产物青霉噻唑酸及青酶胺可与汞盐反应，根据消耗的汞盐量计算青霉素的含量。 青霉素分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子，开环后形成巯基（SH），可用汞量法测定 4、可见紫外分光光度法 原理： 青霉素在弱酸性下（pH=4），不完全水解，产生青酶烯酸，在320360nm处有强吸收。 青霉烯酸在酸性溶液中极不稳定，有两种改进方法。（1）铜盐法（JP13）： 铜离子

8、与青酶烯酸形成稳定的螯合物，在320nm处有最大吸收。 对照品法定量。 用于氨苄青霉素的含量测定。（2）硫醇汞盐法（BP1993,ChP95） 青霉素在咪唑的催化下，与氯化高汞定量地反应生成青酶烯酸硫醇汞盐，在324345nm下有最大吸收。 对照品同样操作 用于氨苄西林钠的含量测定 作用： 咪唑:催化剂,使水解产率高,生成产物稳定 醋酐的乙腈溶液:乙酰化氨苄青霉素侧链 NH2,使max=325nm 硼酸缓冲液:调pH值 HgCl2:微量Hg2+催化剂,促进反应,重现性好。 5、HPLC 以“头孢唑林钠”为例色谱条件： 柱：ODS 流动相：磷酸二氢钾、枸橼酸溶液 乙腈（88：12） 检测波长：2

9、54nm 内标物：乙酰苯胺第二节 氨基糖甙类抗生素的分析一、化学结构及性质（一）链霉素 1、结构 链霉胍N-甲基-L-葡萄糖胺链霉糖 2、性质：（1）三个碱性中心： 2个强碱性胍基（） 1个甲氨基（） 可与矿酸或有机酸成盐（2）链霉素在酸性或碱性条件下可变为链霉胍和链霉双糖胺（二）庆大霉素1、结构紫素胺三个类似结构的C1、C2、C1a组成的混合物C1：R1=R2=CH3 ;C2：R1=CH3,R2=H ;C1a：R1=R2=H,R3=HN-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺脱氧链霉胺 2、性质：（1）五个碱性中心PKa8 可与矿酸或有机酸成盐（2）无UV吸收，（因为无共轭系统）二、鉴别试验（一）

10、共同反应 1、茚三酮反应 氨基糖苷结构，具羟基胺类和- 氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。 2. N-甲基葡萄糖胺反应: 水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应（二）链霉素的特征反应1、麦芽酚反应： 链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。 2、坂口反应： 本品水溶液，加氢氧化钠试液，水解为链酶胍，与8羟基喹啉作用，再加次溴酸钠试液，生成橙红色化合物。第三节 四环素类抗生素的分析一、化学结构 四骈苯或萘骈萘的衍生物，氢化骈四苯环四个取代基RR1R2R3四环素(TC)HOHCH3H金霉素(CTC)ClO

11、HCH3H土霉素(OTC)HOHCH3OH四个环A环B环C环D环二甲氨基N(CH3)2酚羟基酰胺基CONH2酮基与烯醇基共轭酮基与烯醇基共轭双键系统双键系统 二、性质 1、呈两性： 弱酸性酚羟基、烯醇型羟基 弱碱性二甲胺基 所以遇酸或碱均可成盐2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5% 加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分。 3溶解度： 游离体在水中溶解度很小，溶解度与pH有关。难溶于水, pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.4对氧化剂不稳定： 对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快

12、变深形成色素，干燥品较稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。 三化学反应：1. 差向异构化反应：（差向四环素） 弱酸性（）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。 差向化速度的影响因素：pH9时，差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加，差向化速度增大。四环素和金霉素很易差向异构化，形成4-差向四环素、4-差向金霉素，他们的抗菌性极弱或完全消失。土霉素和强力霉素由于C5上的羟基和二甲胺基形成氢键，不易发生差向异构化。 2. 酸性下降解反应:（脱水四环素类）在酸性（pH2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键

13、。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类四环素、土霉素和金霉素可发生脱水； 3. 碱性下降解反应：（异四环素类） 在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。 4. 与金属离子络合： 能与许多金属离子（锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+，铈Ce4+,钴Co2+）形成有色络合物。 四鉴别 1. 与浓硫酸反应：四环素类 + 浓H2SO4 深紫色（四环素） 蓝色,迅速转变为绿（金霉素） 朱红色（土霉素）2. FeCl3反应：四环素类酚羟基 + FeCl3 红棕色（四环素） 深褐色（金霉素） 橙褐色（土霉素）3 荧光反应： 四