酶工程pdf分析

1、第一节概概述述*细胞酶工程是在发酵工程（微生物工程）基 础上发展起来，它与发酵工程的联系极为 密切。酶工程是生物工程的重要组成部分 ： 与基因工程、细胞工程、发酵工程相互依 存、相互促进。，、酶的定义与性质酶(enzyme):是由生物体内活细胞产生的一 种生物催化剂(biocatalyst)。按化学组成分成蛋白质类酶和核酸类酶。二、酶的分类与命名根据作用底物，底物名+ “酶”：如淀粉酶、蛋白酶等；根据反应性质，反应类型+ “酶”：氧化酶根据作用底物和反应性质，如丙酮酸脱竣酶、DNA聚合酶等；根据酶的来源或其它特点，如胃蛋白酶、含铁酶等；存在问题：缺乏科学系统性，易产生“一酶多名”或“一名多酶”

2、问题, 如分解淀粉的酶，若按这种命名法则有三种名称，如淀粉酶、 淀粉水解酶和细菌淀粉酶。系统命名法与分类.系统命名法根握国际生化协会酶命名委员会的贬定 ，每一个酶都用四个 打点隔开的数字编号 ，编号前冠以 EC （酶学委员会缩 写），四个数字依次表示：第一个数为大类，按酶促反应性质分的六大类。 第二个数为亚类，按底物中被作用基团或键的性质分。第三个数为亚亚类，逆一步精确底物的性质。第四个数为亚亚类中的顺序号乙醇脱氢酶的编码是：EC1.1.1.1第一个“1” 一-第1大类，即氧化还原酶类；第 二个“1” -第1亚类，供氢体为CHOH ;第三 个“1” 一-第1亚亚类，受氢体为NAD+ ;第四 个

3、“1” -在亚亚类中的顺序号。.分类(1)氧化-还原酶 Oxidoreductase? 氧化-还原酶催化氧化-还原反应。? 主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶 (Oxidase)等。例如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOH NAD+ CH3 CCOOH NADH H+OHO(2)转移酶 Transferase豺|醒津化举国错秒反应人，、即价1个底物分子 向基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。CH3CHCOOH HOOCCH2cH2cCOOHnh2CH3CCOOHOOHOOCCH 2cH2cHCOOH(3)水解

4、酶 Hydrolase? 水解酶催化底物的加水分解反应。? 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应H2OR-COOCH2CH3ARCOOH + CH3cH20H(4)裂合酶Lyase?裂合酶催化底物分子中化学基团的移去或加 入，包括双键形成及其加成反应。?主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。HOOCCH=CHCOOH B H2OHOOCCH 2CHCOOHOHCHOiIIcOHIHOC-HIHCOHI H-C-OHI 2CH2OPO36-磷酸葡萄糖异构酶(5)异构酶 Isomerase?异构酶催化各种同分异构体的相互

5、转化，即底物 分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。CHO1 C=)IHOCHHl.HCOHI -IIC()HI 2ChOPO；(6)连接酶 Ligase or Synthetase?连接酶，又称为合成酶，能够催化C-C、C- O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应 必须与ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi例如，丙酮酸酸化酶催化的反应丙酮酸+ CO 2+ATP +H 2O t 草酰乙酸+ADP+Pi，81的结构与特性结论：酶是蛋白质大多数酶是蛋酶可被蛋白酶和酸或碱水解，水解产物是氨基 酸；凡是能使蛋白质变

6、性的因素都能使酶变性失 活；酶是两性电解质；酶具有蛋白质一样胶体性 质；酶也有蛋白质所有的化学呈色反应。1926年美国Sumner月尿酶的结晶，开指出酶是蛋白质。白的结1936年：Northrop and Kunitz制备置蛋白幅、胰蛋白幅和胰凝乳蛋晶，开过一步证明的是蛋白质 （1946年诺贝尔化学奖）酶的结构层次与活性关系：酶的一级结构是决定其催化功能最重要的化学结构，是酶发挥催化功能的结构基础。酶一级结极的差别也决定了催化性质的开同，如胰 蛋 白酶、胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶三种蛋白酶的活 性 中心Ser残基附近都有一个在立体结极上的 口袋”状 结极。由于三种蛋白酶的 白袋”状结极开同，决定其

7、 不开同底物结合即有开同特异性。酶的特异的三维空间结极是酶催化功能的基础。酶的二、三级结构是维持酶的活性中心空间构象的必 需结构O寡聚酶和多酶体系同时具有四级结极。(二)酶的化学组成,单纯酶(simple enzyme):只需要其蛋白质部分就具有催 化功能的酶。如胃蛋白酶，核糖核酸酶，淀粉酶等。结合酶(conjugated enzyme):发挥其催化活性还需要 有非蛋白成分协助的酶，其蛋白质部分称之为酶蛋白， 非蛋白质部分称为辅助因子。 酶蛋白不其辅助因子一起 合称为全酶。辅酶(coenzyme):不酶蛋白疏松结合，通过透相方法 可以除去。如：/甫酶I和辅酶n等。辅基(prosthetic g

8、roup):不酶蛋白牢固结合,TT能通 过透相法除去，需要经过一定的化学处理才能不酶蛋白 分开。如：细胞色素氧化酶的铁吓咻等。(三)酶的活性中心(active center)和必需基团又称活性部位(active site):指酶分子中不底物结合 开将底物转化为产物的空间结极区域。活性中心必需基团(essential group):酶发挥催化作用所必需的：结合基团(binding group)催化基团(catalytic group)常见基团：His残基的咪嘎基、Ser残基的羟基、Cys残基的疏基及Glu残基的丫竣基。活性中心以外的必需基团：为维持酶活性中心应有 的空间极象所必需。活性中心（四）

9、酶的催化特性酶促反应的特点：高度与一性催化效率高条件温和（酶易失活）酶活力可调节控制? 一种酶只作用于一类化 合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化， 生成一定的产物，这种 现象称为酶作用的专一 ft (specificity) 。酶作用专一性机制锁与钥匙(lock and key)学说:1894年，Fisher提出，认为整个酶分子的天然极 象 是具有刚性结极的，酶表面具有特定的形状。 酶不 底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。此学说可以较好的解释酶的立体异极与一性；但开能解释：酶的多底物现象、酶的正反方向催化等。诱导契合(Induced-fit model)假说:酶不底物相互接近时，其结极

10、相互诱导、相互变形 和相互适应，逆而相互结合。这一过程称为酶-底物 结合的诱导契合假说。2.化白催化反应历程：一般化学反应历程：S. rP酶促反应历程：S + E ES , A E + P化学催化剂：高温、高压、强酸或强碱酶：常温、常压、中性pH四、酶的来源2M动植物组织中分离提取?植物细胞培养产酶砌物细胞培养产酶?微生物发酵产酶繁殖快、生活周期短、产酶量高，酶比活高；培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量 高的菌种；繁殖快、产酶量高能在便宜的底物上生长良好产酶性能稳定、菌株开易退化产生的酶容易分离纯化五、酶

11、促反应动力学酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反 应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时 ，通常测定其 初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量5%时的 反应速度。 初速度产酶促反应速度逐渐降低（一）中间络合物学说=Vniax一EnzymeSubstrate concentration/SSubstrate moleculeAH20反应级数S当底物浓度较低时：J反应速率与底物浓度成正比 为一级反应。随着底物浓度的增高反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。度定量关系的数学方程式LG，-our Michaelis1B75-1949X*aud Men ton rI8

12、7LJ-1%O(二)米氏方程(Michaelis-Menten equation )1913年Michaelis和Menten提出反应速度不底物浓VmaxS VKm +SS：底物浓度V： TT同 S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity)指酶完全被底物分子饱和时的反应速度K m :米氏常数(Michaelis constant)六、酶的分离纯化与酶的活力测定（一）酶的分离纯化?胞外酶：一类由细胞内产生然后分泌到细 胞外进行作用的酶，这类酶大多都是水 解酶类。?胞内酶：另一类酶在细胞内合成后在细胞 内起催化作用的，这类酶数量较多。取液抽提胞内酶对于细胞外酶可用水、缓

13、冲液浸泡过滤后，可 得粗抽提液。对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎 ， 通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提 液。细菌细胞壁较厚，需用超声波、细菌磨、溶菌 酶等方法破碎。一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来抽提条件：抽提溶液的pH选择应该在酶的pH稳定范 围之内，开丐最好进离等电点。低温下抽提（040C）1抽提液中除含有所需酶外，还含有其它大分子和小分子物质。常用分离纯化的方法：盐阴法有机溶剂沉 淀 法等电点沉淀法 吸附分离法等。?本艮据大/卜/口形犬 ：离心；凝胶柱过滤；透析与超滤。?根据溶解度不同：盐析（硫酸氨法）；有机溶剂沉淀；等电点沉 淀；大分子聚合物共沉淀。?根据电

14、荷性质：离子交换层析；等电聚焦；聚焦层析。?根据专一性结合 ：亲和层析；免疫吸附层析；染料配体亲和层析； 共价层析。?根据稳定姓.差异:热变性；酸碱变性。?分配系数：双水相萃取。酶分离和纯化的注意事项：防止强酸、强碱，要求加入的化学试剂开使酶变性 ；在低温下操作，全部操作在低温04C；在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量, 死基乙醇；在开破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的 手感。衡量分离提纯方法优劣的指标：总活力的回收率（表示提纯过程中酶的损失情况） 比活力提高的倍数（表示提纯方法的有效程度）?总活力=活力单位数/ml酶液x总体积（ml）?比活力

15、=活力单位数/mg蛋白（氮）=总活力单位数/总蛋白（氮）mg?纯化倍数=每次比活力/第一次比活力?回收率（产率）=每次总、活力/第一次总活力X100%（二）酶的活力测定_- 一 I陶!施flniymeactKityf（躯D： 3在最适条邮F侬笺最酷催化一定力般采用高底物浓度测定反应初速度，以定量酶浓度产物浓度斜率=浓度/时间=口初速度时间常RI反应时间酶活国际窜位僦（IU） :1游25?曲最适条件下（最适，pH ,麒适底 野磁鹰），3每分钟辑博伽 中。魔底物为烦的酶量。m i iu =y冒1即01/加.也Katal （简称 Kat ）尸：为25?最翦条拿带/四嘴辘1m嘲底物颇构的电量。h化嗡二的旗日 IU 不 Kat 的换算：1Kat = 6xi07|U2.酶的比活力（specific activity指每mg蛋白所含的酶活性单位或每kg蛋白中所含的Kat