大肠菌群三步法和两步法比较

1、关于大肠菌群三步法与两步法的比较第一张，PPT共二十四页，创作于2022年6月试验菌种培养基培养稀释、混匀待用设置空白对照与多个平行样品制备检验过程样品三步法两步法乳糖发酵平板分离证实试验初发酵复发酵查MPN检索样品中的总大肠菌群MPN值，统计学方法计算试验样品按照不同模拟污染水平进行人工添加第二张，PPT共二十四页，创作于2022年6月需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污

2、染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。广泛应用于食品卫生工作第三张，PPT共二十四页，创作于2022年6月样品制备1.试验样品种类与数量选择 为了模拟大肠菌群在不同样品中生长环境不同，样品组成不同，选用种类不同的样品，如水、食物、化妆品等，食物样品又可分为肉类、乳制品、水产品、淀粉类、蔬果类等，同时避免选择添加了防腐剂的样品。选择合适的种类数与数量，处理前经检验确定无大肠菌群与干扰菌或进行高压蒸汽灭菌。2.空白试验 在分析工作中，存在着系统误差，包括试剂及用水含有杂质所造成的误差等，为消除这部分影响，提高分析准确度，所以要做空白试验。第四张，PPT共二十四

3、页，创作于2022年6月样品制备3.菌株选择 将大肠菌群标准菌株（包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌）于培养基中35培养24h后混合。4.菌落计数 用灭菌的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液比生理盐水（NS）合适。因为PBS在稀释的同时可以保护菌体，调节pH值，而且市面上有成品出售；而NS只是纯粹的稀释液。)进行十倍系列稀释至10-10，用后4个稀释度*用营养琼脂计数。每种浓度吸取1mL加到融化温度46的15mL左右营养琼脂培养基中混匀凝固，35摄氏度培养24h，取出进行菌落计数。（*：赵贵明，边凌淳，应用不同方法检测食品中大肠菌群结果的比较，微生物学杂志，2003年11月

4、第23卷 第6期）第五张，PPT共二十四页，创作于2022年6月样品制备菌落计数流程图 1.选择平均菌落数在30300之间者进行计算，若只有一个稀释度平均菌落数符合此范围，则将该菌落数乘以稀释倍数报告。2.若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数字。3.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则报告未

5、检出。361482h做成几个适当倍数的稀释液选择23个适当稀释度，各以1mL分别加入灭菌平皿内每皿加入适量的营养琼脂菌落计数报告检样第六张，PPT共二十四页，创作于2022年6月样品制备5.试验样品制备 按照不同样品类别分别按规定加入磷酸缓冲液处理，每份样品分高、中、低三个水平进行菌悬液人工添加，高度污染为添加600-1200CFU/g，中度污染添加120-600CFU/g，低度污染添加30-120CFU/g，以保证样品含菌数量在检测范围内。同时用相同样品做三份平行试验与一份空白试验。均质后，-18保存备用，试验前用无菌磷酸缓冲液稀释至10-3。第七张，PPT共二十四页，创作于2022年6月检

6、验方法：三步法与两步法三步法：水样接种到双料乳糖蛋白胨培养液中培养产酸产气的发酵管转种在伊红美蓝琼脂平板上培养挑选可疑菌落染色、镜检、证实试验乳糖发酵试验分离培养证实试验两步法：接种月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤培养从产气的LST肉汤管中取培养物移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中培养初发酵试验复发酵试验第八张，PPT共二十四页，创作于2022年6月三步法所用培养基及其作用乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 牛肉膏提供碳源 乳糖大肠菌群可分解的糖类 氯化钠可维持均衡的渗透压 溴甲酚紫乙醇溶液产酸指示剂 蒸馏水溶剂伊红美蓝培养基 蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求

7、 乳糖大肠菌群可分解的糖类 磷酸氢二钾中和过量酸 琼脂培养基固化剂 蒸馏水溶剂 伊红水溶液大肠菌群特异性指示剂 美蓝水溶液大肠菌群特异性指示剂 第九张，PPT共二十四页，创作于2022年6月两步法所用培养基及其作用月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 氯化钠可维持均衡的渗透压 乳糖大肠菌群可发酵的糖类 磷酸氢二钾（K2HPO4）缓冲剂 磷酸二氢钾（KH2PO4）缓冲剂 月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群细菌的生长 蒸馏水溶剂煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求 乳糖大肠菌群可发酵的糖类 牛胆粉（oxgall或oxbile）

8、溶液抑制非肠杆菌科细菌 0.1%煌绿水溶液抑制非肠杆菌科细菌 蒸馏水溶剂第十张，PPT共二十四页，创作于2022年6月两步法所用培养基可否添加指示剂？对于LST而言：大肠菌群分解乳糖产酸产气，如果用指示剂一般就是用酸碱指示剂，LST培养基里有月桂基硫酸钠（SDS十二烷基硫酸钠），它是阴离子表面活性剂，水溶液呈碱性，为了让大肠菌群生长，培养基里就需要用磷酸缓冲液维持PH中性，所以加了酸碱指示剂也没有什么用。对于BGLB而言：BGLB中的煌绿本身就是指示剂，在培养基中呈绿色，它的指示范围是0.0（黄）2.6（绿），一般培养过程中都是绿色，不具有典型性和代表性。但是也有少数情况培养出来酸产生的过多变

9、成了黄色，所以加了指示剂可能会干扰现象观察。加之大肠菌群分解乳糖产酸产气，有气泡就能判断，不用加指示剂。第十一张，PPT共二十四页，创作于2022年6月月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤这两种培养基相对于乳糖胆盐蛋白胨水有什么特别之处？ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）乳糖蛋白胨培养基成分（g/L）胰蛋白胨（20.0）氯化钠（5.0）乳糖（5.0）磷酸二氢钠（2.75）磷酸氢二钠（2.75）月桂基硫酸钠（0.1）蛋白胨（10.0）乳糖（10.0）0.1%煌绿水溶液（13.3mL）牛胆粉溶液（200mL）蛋白胨（10.0）乳糖（5.0）牛肉

10、膏（3.0）溴甲酚紫乙醇溶液（16.0,1mL）氯化钠（5.0）碳源/氮源乳糖/胰蛋白胨乳糖/蛋白胨乳糖、牛肉膏/蛋白胨抑制剂月桂基硫酸钠（阴离子表面活性剂）煌绿、胆盐无第十二张，PPT共二十四页，创作于2022年6月LST、BGLB、乳糖蛋白胨培养基的区别1.氮源区别BGLB与乳糖蛋白胨培养基氮源为蛋白胨，LST培养基氮源为胰蛋白胨（蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。）（胰蛋白胨，又称胰酪蛋白胨、胰酶消化酪蛋白胨，是一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。）主要区别在于：胰蛋白胨处理后，很多大分子的蛋白分子量变小，这样的话

11、，细菌更容易利用。价格较蛋白胨贵。第十三张，PPT共二十四页，创作于2022年6月LST、BGLB、乳糖蛋白胨培养基的区别2.培养基中的抑制剂区别LST培养基中为月桂基硫酸钠（SDS），为阴离子表面活性剂，有表面活性作用，有利于提高革兰阴性菌活性与分散菌体的作用，就有更好的分离效果。所以作为鉴别的培养基。BGLB中煌绿是一种抑菌剂，主要抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌。由于本培养基的抑菌作用非常强，所以可以排除一些假阳性的结果，常用作确证试验。乳糖蛋白胨培养基中没有加入抑制剂，所以需要用伊红美蓝培养基做特异性鉴别。第十四张，PPT共二十四页，创作于2022年6月三步法流程图检样稀释乳糖蛋白胨

12、培养基361,24h2h不产气大肠菌群阴性产气伊红美兰琼脂平板报告361，18h-24h革兰氏染色乳糖蛋白胨培养基革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌大肠菌群阴性报告大肠菌群阳性产酸产气不产酸产气报告361，24h2h大肠菌群阴性报告第十五张，PPT共二十四页，创作于2022年6月乳糖蛋白胨培养基中大肠菌群生长现象大肠菌群分解乳糖蛋白胨培养基产酸产气。溴甲酚紫是pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。大肠菌群发酵后呈黄色，空白对照呈紫色。大肠菌群发酵后产气，倒管内有气泡。空白对照则无气泡。第十六张，PPT共二十四页，创作于2022年6月伊红美蓝培养基上大肠菌群菌落现象当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷

13、被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。第十七张，PPT共二十四页，创作于2022年6月 检样：25g（或25ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36148h2h不产气 产气BGLB肉汤361大肠菌群阴性大肠杆菌阳性不产气产气查MPN表报告结果两步法流程图48h2h第十八张，PPT共二十四页，创作于2022年6月大肠菌群在LST培养基中现象大肠菌群在LST培养基中产气，倒管内有气泡。第十九张，PPT共二十四页，创作于2022年6月大肠菌群在BGLB培养基中生长现象大肠菌群分解乳糖产酸产气，阳性结果倒管内均有气泡。

14、若产酸过多，由于有指示剂煌绿存在（指示范围pH0.0黄-2.6绿），则由绿色变为黄色（右）。第二十张，PPT共二十四页，创作于2022年6月结果计数前提：若空白对照无大肠菌群检出，证明实验无系统误差干扰，结果准确性可以保证。计算三步法与两步法最终确证的大肠菌群阳性管数，检索国标中的MPN表，统计好每个样品MPN数。根据样品制备时加入的不同梯度（高、中、低）菌落形成单位与查询MPN表，看实际添加菌落形成单位是否落在MPN表的95%置信区间内。统计好两个方法落在范围外以及阴性管数与阳性管数。第二十一张，PPT共二十四页，创作于2022年6月MPN表MPN(Most Probable Number) :