沙门菌监测标本采集及检测的基本要点

1、附件2：沙门菌监测标本采集及检测的基本要点一、标本采集标本采集应在2小时内用无菌方法采集新鲜标本，置于灭菌容器中或直接接种于增菌培养基中，写上标本编号并填写采样登记表，将标本与采样登记表一同送到指定实验室，如路途较远，标本要存放在专用的标本运送箱内，包扎好以免容器破损。粪便标本宜在服用抗菌素前采集，尽快送检。(1)留便用棉拭子采取自然排出的新鲜粪便23克。(2)肛拭用棉拭子在生理盐水中蘸湿后(棉拭子贴管壁挤出多余的液体)，轻轻旋转插入肛门内约45cm(婴幼儿约23cm)处，于紧靠肛环边的隐窝处旋转采集直肠表面黏液后退出，棉拭上要沾有粪便。采集的粪便标本立即放置采样管送检，如2小时内不能送检时，

2、将肛拭或用采样拭子沾满粪便插入运送培养基(Cary-Blair,C-B)内保存，常温条件下运送至实验室。可疑食品标本固体食品需剪碎和研磨，奶和奶制品可直接取样增菌。二、标本增菌1.粪便标本将标本立即接种于加有磺胺抑菌剂亚硒酸盐煌绿的增菌液(SeleniteBrilliantGreenSulfaEnrichment,SBG),37C培养1824h。哨点医院可先将标本插入35ml缓冲蛋白胨水(BufferedPeptoneWater，BPW)中37C预增菌46h，然后再将预增菌处理后的标本按检验项目要求取0.1ml接种至9ml各相应选择性增菌液37C培养1618h。2.食品标本可疑食品固体25g研

3、磨后或液体25ml先于225mlBPW中37C812小时进行前增菌。取前增菌液0.1ml加入9mlRVS中，置40C继续增菌1618小时（此项仅用于暴发食物中毒原因调查时）。具体操作及所用的培养基、鉴定方法参考中华人民共和国国家标准（食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验）GB4789.4-2010。三、分离培养接种环提取1满环（约10ul）增菌液，划线分离到科玛嘉沙门菌显色培养基/HE、XLD（木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂）琼脂平板各1块，置37T24h分离培养，如果没有观察到有可疑菌落生长，再继续培养24h，观察结果，挑取可疑菌落（见表1）。表1沙门菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征选择性培养基沙

4、门菌大肠埃希菌菌落颜色、形态菌落颜色、形态MaC无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则XLD粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则科玛嘉紫色、光滑、湿润、边缘整齐、圆形蓝色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则DHL无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则SS无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则HE蓝绿色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形a黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则血平板无色、透明、无溶血环、光滑、湿润

5、、边缘整齐、圆灰白色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则注：a.产H?S的菌落呈黑色四、生化鉴定和血清分型生化初筛：从上述各平板上分别挑取至少5个可疑菌落，转种到双糖铁琼脂斜面（KIA）,37C1824小时培养，观察初步生化反应（见表2）。第一天：KIA:穿刺2/3中段，在斜面上划线。36C培养1824h，观察生化试验结果。第二天：符合沙门菌KIA反应的，取该管斜面菌苔转种：MIU:穿刺接种培养基，并沿穿刺线拔出接种针。赖氨酸脱羧酶：接种少量菌苔，倒一层灭菌的石蜡油在上层。ONPG:接种一满环菌（2h读取试验结果）。（营养琼脂斜面：在斜面上划线，用于氧化酶试验，并做药敏试验及菌种保存的准备。）

6、36C培养18h24h，第三天：观察赖氨酸脱羧酶反应试验结果。符合：K/A、产气+、H2S土、动力+、靛基质、尿素、ONPG、赖氨酸+、氧化酶结果者，做血清分型试验。表2.用克氏双糖（KIA）、动力-吲哚-尿素（MIU）、赖氨酸脱羧酶及氧化酶生化反应初步鉴别沙门菌与其它常见肠道菌细菌KIAMIU赖氨酸ONPG.氧化1酶斜底层HS气体动力吲哚尿素沙门菌属KADD+-+-伤寒沙门菌wKA+-+-+-甲型副伤寒沙门菌KA-+-乙、丙型副伤寒沙门菌KA+-+-亚利桑那菌属DA+-+-普通变形杆菌KA+D+-奇异变形杆菌KA+-+-摩根变形杆菌KA-DD-+-雷极变形杆菌KA-D+-枸橼酸菌属DAD+w

7、+-D-+-爱德华氏菌属KA+-+-痢疾志贺氏菌（AKA-D-群）福氏痢疾菌（B群）KA-D-鲍氏痢疾菌（C群）KA-D-宋内氏痢疾菌（D群）KA-+-大肠菌属”AA-+）D-+-大肠菌产碱-殊异株KA-+-D+-克雷伯氏菌属AA-+-D+-产碱普罗菲登斯菌KA-D+-司徒氏普罗菲登斯菌KA-+-小肠结肠炎耶氏菌KA-VD+-+-气单胞菌属KA-+-D+邻单胞菌属KA-+-+-+弧菌属KA-+-+/-+哈夫尼亚菌属DA-+-+-产气肠杆菌nAA-+-+-阴沟杆菌AA-+-D-+-注：A产酸（黄色）；K碱性反应（红色）；W=弱或迟缓反应；D=不同生化型，反应不同。侵袭性大肠菌无动力；某些福氏痢疾

8、菌血清6型产气；鲍氏痢疾菌血清13和14型产气；小肠结肠炎耶氏菌25C培养有动力，但37C培养无动力。2血清学玻片凝集反应分型：挑取符合沙门菌初步生化反应的KIA斜面上菌苔，做A-F多价血清玻片凝集（设盐水对照）。如果0多价血清不凝集，则用Vi血清鉴定Vi抗原。将细菌制成悬液，经100C水浴30分钟，破坏其Vi抗原，然后再与0多价血清凝集。多价血清凝集的菌株及可疑菌种接种半固体菌种管保存以备复核及移交。3血清学分型：分析抗原组成成分是鉴定沙门菌属血清型的主要方法。一般均按Kauffmann-white沙门菌属进行鉴定。本菌属抗原构造复杂，包括2500多个血清型，但根据血清型调查，98%以上沙门

9、菌都属于A-S19个O血清群，常见的血清型也仅有20多个，因而可缩小鉴定范围。通常先做菌群分析，再做菌型分析，结合生化反应结果，作出最终鉴定。菌群分析：先用多价O血清与被检菌作玻片凝集试验，然后再用代表群因子血清凝集定群；如不凝集但仍不能排除沙门菌者，作为可疑菌株保存上送做进一步的检查。粗糙型（R型菌）沙门菌也可引起自凝现象，可以在血平板或M-H平板上纯培养以恢复光滑的状态（S型菌），再重新进行凝集；含Vi抗原的菌株要用Vi血清检查（取浓菌液隔水煮沸30分钟后，再与A-S血清作凝集反应定群）。确定0群后，分别选择相应的H因子血清检查第1相抗原，如为双相菌，在检出第1相H抗原后，进一步用复合因子

10、血清检查第2相H抗原，如双相菌仅检出其中一相H抗原时，应用位相诱导法检出另一相H抗原。最后综合0、H及Vi因子血清检查的结果判定细菌型别。生化鉴定：血清学可分型的菌种应用API-20E生化试剂条做进一步生化鉴定（略）。药物敏感试验：参照美国临床实验室标准化研究所（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的琼脂平板扩散法进行（略）。五、分离菌株的登记、保存与移交菌株的登记对所有分离到的伤寒、副伤寒及非伤寒沙门菌菌株，记录到江西省伤寒、副伤寒及非伤寒沙门菌监测阳性菌株登记表中，同时每次监测时都应做好实验原始记录，以便监测项目督导时查阅及资料汇总。菌株的保存与移交：对分离到的所有伤寒、副伤寒及非伤寒沙门菌株，均应按时送至江西省疾病预防控制中心传防所实验室进行复核鉴定。每次菌株移交均应附阳性菌株送样单。菌种的管理：所有分离菌株的原始资料、实验室鉴定试验结果、菌种保存编号，全部输入数据库进行管理。编程建立每一个病人