柚苷酶及柠檬苦素酶

1、柚苷酶及柠檬苦素酶一、柑橘中的苦味物质柑橘类果实的苦味物质主要有以柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等为代表的黄烷 酮糖苷类化合物和以柠檬苦素、诺米林等为代表的三萜系化合物的衍生物一柠檬 苦素类似物。1、柚皮苷的结构和分布柚皮苷(Naringin)是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑橘苷、异橙皮 苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-P-D-葡萄糖(2-1)-a-L-鼠李糖，分 子式C27H32i4，分子量580.55，其结构式如图1所示。图1- 1柚皮苷的结构式主要存在于芸香科植物柚(Pummelo,Citrus,grandis)、葡萄柚(Grapefruit，Citrus paradi

2、si)、 酸橙(Sour orange,Citrus aurantium)及其变种的果皮和果实中，以及枳实、枳壳、骨碎补、化 橘红等中草药中。普通柚果汁中柚皮苷含量为40-138 ppm，葡萄柚汁中柚皮苷含量为136-362 ppm，枳实、枳壳及化橘红中柚皮苷含量分别为1.87-22.72%和0.3-29.2%，因产地、品种、 原料成熟度不同而异。骨碎补中柚皮苷含量为0.3-1.5%。此外，枸桔果实及叶、梧桐科植物 球穗千斤拔叶、唇形科植物牛至以及蕨类植物如Ceterach officinarum和铁线蕨属的一些种 类组织中也含有柚皮苷，但这些植物中柚皮苷的含量较低。柚皮苷在蒸馏水中苦味阀值为

3、 20 mg/L，在果汁中约为30 mg/L。其溶解度随含糖量的增加而升高，随pH值的升高而降低， 在没有成熟的柑橘果实中柚皮苷含量最多。2柠檬苦素类似物2.1柠檬苦素类似物的结构和分布柠檬苦素类似物又称类柠檬苦素(Limonoids)，是一类具有吠喃环的三萜类 化合物。类柠檬苦素具有高度氧化的三萜醇类诱导体结构，与C-17位的吠喃结 合，形成C-3位或者C-6位的内脂环，具有C-14、C-15位向的环氧化物特征， 主要以游离苷元和配糖体两种形式存在，见图2。图2柠檬苦素类似物及配糖体的结构类柠檬苦素游离苷元不仅水溶性差，而且味苦，是大多数柑橘类水果苦味物 质之一，也是使果汁及其他加工制成品产

4、生“后苦味”的物质。现已从柑橘类中 分离得到38种类柠檬苦素苷元，较常见的主要有柠檬苦素(Limonin)、诺米林 (Nomilin)、宜昌根辛(Ichangensin)、脱乙酰诺米林(Dealcetrylnomilin)、诺米林酸 (Nomilin acid)、脱乙酰诺米林酸(Dealcetrylnomilin acid)等，其中柠檬苦素和诺 米林具有强烈苦味。类柠檬苦素配糖体(Limonoids glucoside)是由类柠檬苦素苷元分子D环开环 后在C-17的位置上以糖苷键的形式结合一个五碳糖而构成的，是在植物体内经 过一系列非常复杂的生化过程而合成的，大多溶于水溶液，在pH2-8范围内

5、比较 稳定，无苦味，且仍保留与其相应的苷元相似的生理活性。一般情况下，有多少 种类柠檬苦素，就该有相应数量的配糖体，但目前从柑橘中只分离出了 22种类 柠檬苦素配糖体。柠檬苦素类似物是三萜的一种高度氧化型衍生物，柑橘属中发现有60余种 柠檬苦素的甙元及甙，是芳香科橘属植物如橘、柠檬的种子及果汁中的强苦味成 分。目前已从柑橘类中分离得到38种柠檬苦素类似物，其中酸性15种，中性 23种，已经证实柠檬苦素、诺米林素等具有抗癌活性和抗肿瘤特性。酸性类柠 檬苦素仅占总配基的20%左右，可溶于水溶液，除个别外都不呈苦味。而中性类 柠檬苦素例如柠檬苦素、诺米林不大溶于水且大都呈苦味。类柠檬苦素主要存在于果

6、实中，而在茎、叶等组织中含量较少。在幼果中， 类柠檬苦素多以苷元等形式存在，随着果实不断发育，苷元逐步转化为配糖体， 作为一种贮存形式存在于成熟果实中。几乎所有的柑橘果实都是以种子含量最 高，其次为果皮，在果汁中含量最低。种子中的类柠檬苦素苷元含量通常要高于 其配糖体，比例大概为2.2:1，而在果实中其比例为1:150。柑橘中的柠檬苦素类似物以柠檬苦素和诺米林为主要，诺米林因含量很低， 对苦味影响赶不上柠檬苦素，故目前研究仍以柠檬苦素为主。柠檬苦素苦味阀值 很低，水溶液中1.0 mg/L，橙汁中3.4 mg/L，60%的人能感觉到苦味。2.2柠檬苦素呈苦机理在果实成熟期间，柠檬苦素可在一些酶的

7、作用下转化为相应的糖苷而不呈苦 味，故柠檬苦素含量随着柑橘果实的成熟而有所降低。在采收时，一般糖苷含量 大于柠檬苦素，而感觉不到苦味。其实，柑橘中柠檬苦素的前驱物-A环内酯柠 碱酸盐是没有苦味的，但压榨后变成具有强烈苦味的柠檬苦素。这就形成了榨汁 “延迟苦味”(Delayed bitterness)现象。其机理为A、D的内酯环开闭决定苦味的 产生，D环闭环型(柠檬苦素)有苦味，而开环型A环内酯没有苦味。当压榨 时，在酸性条件下，柠檬苦素前体物质柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素D-环内酯 水解酶作用下，转化为柠檬苦素，而使果汁呈后苦味。戢苦U M、山图顽柠檬苦素呈苦机理柠株佛俄烈舌扁二、酶法脱苦目前

8、，柑橘汁脱苦问题的研究热点集中在生物酶法脱苦上。酶法脱苦具有专 一性强、对柑橘果汁风味和营养成分无破坏、效果好、成本低等特点，是目前较 为理想的脱苦方法。酶法脱苦主要是通过不同的微生物或酶来降解苦味成分柚皮 苷和柠檬苦素，生成不含苦味的物质。柚皮苷酶是针对降解柚皮苷的酶。它是由a-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)和 P-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)组成的一个酶系，是一种胞外酶，最适pH 3.5左右。 柚皮苷首先被a-L-鼠李糖苷酶水解成略有涩味但无苦味的樱桃苷(Prunin)和鼠李 糖(Rhamnose)，樱桃苷(Prunin)的苦味是柚皮苷的1/3，苦味有所减轻。然后在樱 桃

9、苷(Pruning 0-D-葡萄糖苷酶的作用下变成无苦味的柚皮素(Naringenin)和葡萄 糖(Glucose)。Naringin a-L-rhamnosidase_Prunin + RhamnosePrunin-3-D-glucosidase_Naringenin + Glucose江钊等人用黑曲霉变异株ZG86进行柚苷酶固体发酵，发酵酶活力达到15000 u/g豆饼粉，利用此酶对柑橘果汁脱苦，可使柚皮苷含量大幅下降，苦味脱除率 达90%。同时发现pH为3.64.6时脱苦效果较好，而一般柑橘果汁的自然pH为3.6 左右，因此脱苦时可以不调节pH。何晋浙等脱除果醋中苦味，在发酵温度25-

10、28 C，酸度在0.5-0.8 g/mL，柚苷酶加量在15 u/mL时，柚苷酶有较佳的活性，酒 精度为6.0%-8.0%时，有利于醋酸发酵，制得的果醋基本无苦味。单杨等研究用 复合酶制剂Naringinase和Sumizyme C对柑橘发酵酒的最佳脱苦条件是温度 50 C，pH 4.0，Naringinase和Sumizyme C各加0.1%，溶解保温2 h，感官评价效 果较好。A.C.Olson等把酶固定于中空纤维上脱除柑橘汁中的柚皮苷；Ono把柚苷 酶固定于纤维素酯上脱去柚皮苷。刘虎成等以AS1.14为菌种，采用K-角叉胶进行 包埋，在25 C,摇床转速150 r/min，添加1%乙醇于液

11、体培养基中，在此条件下脱 苦率达58.3%；固定化细胞生物反应器在流速2 mL/min处理柑橘汁后基本无苦 味，pH从3.8下降到3.7，维生素C损失8%，可溶性固形物损失7%。每次处理柑 橘汁120 mL，可连续使用11次，脱苦率仍达51.08%。徐仲伟等人采用150 u和180 u的固定化柚苷酶水解柚皮苷，苦味脱除率分别为41.0%和49.7%，并且该固定化 酶比自然酶具有更广泛的pH和温度适应范围，以及较高的热稳定性。同时他们 发现，柑橘果汁用固定化酶脱苦处理后，未产生任何异味。2004年王鸿飞等实验 研究发现，在pH值为4、温度为60 C、柚苷酶用量0.5 g/L、作用90 min对柑

12、橘果 汁进行脱苦，脱苦率为90.55%。但由于柑橘类果实品种繁多，所含苦味成分及其 含量不尽相同，苦味有轻有重，对于不同品种的柑橘类果汁用柚皮苷酶脱苦其效 果是有差异的。因此，用柚皮苷酶对不同柑橘类果汁的脱苦，还有待于进一步研 究。柠檬苦素的脱除可利用柠檬苦素脱氢酶、柠檬苦素裂解酶、柠檬苦素脱氧酶、 诺米琳脱氢酶和诺米琳脱氧酶等。该类酶可使柠檬苦素D-环内酯开环产生无苦味 的柠檬苦素衍生物，但它只是一种权宜之法，因为在果汁天然的酸性环境中 (pH3.0-3.5)，D环可以重新关闭。但若使用柠檬苦素脱氢酶打开D环，则可以使 柠檬苦素D-环内酯转化为无苦味的A-环内酯，这是一种有效的脱苦方法，但此

13、 法还未用于生产。早在1981年，Vaks等从土壤中筛选出不动杆菌(Acinetobacter sp.)，发现该 菌能将柠碱转化为脱氧柠碱，继而转化为脱氧柠酸而达到脱苦的目的。1983至 1985年间，Hasegawa等先后将球形节杆菌、球形节杆菌II、棒状杆菌固定于丙 烯酰胺上，用于柑橘汁的脱苦，对柠檬苦素和诺米林的脱除效果好。后来他又发 现假单胞菌p.321-18能诱导产生两种酶，即柠碱盐脱氢酶和脱氧柠碱水解酶，最 适pH8.0左右，能将果汁中柠碱水解为柠碱盐A-环内酯，从而降低了果汁中柠 碱的含量。现在己有采用聚丙酰胺凝胶固定球形节杆菌（A.globiformis）用于脐橙 汁脱苦，能有

14、效的将柠碱和诺米林转变为非苦味物质，而对果汁其他成分几乎不 产生影响。1988年，Hasegawa发现某些种类的柑橘中存在类柠檬苦素-UDP-葡 萄糖转移酶，它将类柠檬苦素上连接一个葡萄糖而将柠檬苦素转化为不苦的类柠 檬苦素葡萄糖苷。1995年，Hasegawa找到了编码类柠檬苦素-UDP-葡萄糖转移 酶的基因，他们准备利用基因工程将该基因引入柑橘细胞中，希望达到自然脱苦。 1997年，Hasegawa从脐橙白皮层得到粗蛋白，经过40%-80%硫酸铵盐析，DEAE 离子交换柱层析，得到柠碱葡萄糖苷转移酶，该酶可同时催化柠碱和诺米林两者 的糖苷的生成。罗水忠等人探讨了乳酸菌对常山胡柚果汁中柠檬苦

15、素的降解性能，从多种菌 株中筛选到一株链球菌属乳酸菌，在培养48 h后对胡柚果汁柠檬苦素降解率达 66.7%。江钊等人进行了柑橘果醋加工中柠檬苦素的微生物酶降解研究，微生物 酶在pH 7.0、作用温度为40 C的条件下，发酵后的果醋其柠檬苦素降低率达 55.6%。醋酸杆菌AS1.41是食品工业上常用菌种，安全无毒，常用于生产食醋。 罗自生等人将醋酸杆菌AS1.01，AS1.41，AS1.44，AS1.216四个菌株对柑橘汁 柠碱的脱苦进行比较，研究发现AS1.41效果最好。在温度25 C，150 rpm转速 下，脱苦率可达58.3%。其作用机制未见探讨。三、产酶菌株筛选及分离柚昔酶的产生菌及其

16、培养美国和日本大都采用Aspergillus niger菌株；南朝鲜用的是Aspergillus ni- dulans菌株；国内（上海工微所）1967年曾研究过Asp.niger, Asp. Usamii自然 变异株，桔醵菌株等。黑曲霉菌的培养（】）培养基：1用玉米浆，4 大豆粉,2豹葡萄糖，0.5% 鼠李糖，0.2%KH,P。，0.005% CaClt*2HiOt O.Ol MgSOlHQ 。,5 豹 CaCO&；（2）培养条件：PH6.0, 3712好气培养4天（X立升罐）柚昔前的分离将培养液过滤得滤液，加入60啊饱和硫酸镂，离心收集析出物，然后重新溶解于2。0毫 升水中，以去离子水在5

17、P透析2天,加入4倍于透析前液量（体积）的冷乙醇，最后离心 收集析出物并加以干燥.所得柚背酶的活性为73.9单位/毫克，柚甘酶的等电点为PH 5左 右.柠碱前体的脱氢酶，研究得较多的有两种：一种是由Arthro bacter globiformis 菌株所产生胞内酶，简称LD-Ag ；另一种由Pseudomonas specis 321-18菌株所产生，.简称LD-Ps,后者性能比前者好，并已获得美国专利权。.1.产酶菌株及其培养（1 ） LD-Ag以Arthrobacter globiformis为产酶菌株，以1 %柠碱前体的 钠盐作唯一碳源，另加一些无机盐，在2立升锥形瓶内（400毫升培养基接种L0毫升预