新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定

1、新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的断定兰风华杨渤生卢爱薇黄梁浒朱忠勇【关键词】肾上腺白质营养不良IdentifiatinfanvelutatinintheALDgenefahinesepatientithadrenleukdystrphy【摘要】目的：对1例肾上腺脑白质营养不良ALD患者及其家系成员的ALD基因的突变范例举行断定.要领：以外周血RNA为模板，接纳长链RTPR技能，分4个片断扩增ALD基因RNA的编码序列，对4个PR产物举行直接测序，筛查整个基因编码区.通过限定性内切酶酶切阐发患者及其家系成员基因组ALD基因片断，以进一步确证所创造的基因突变.效果：位于患者ALD基因第6外显

2、子的第508位暗码子存在一个新的错义突变T(P508L)，患者母亲为突变携带者，患者父亲和妹妹不存在此突变.结论：创造中国ALD患者一个新的ALD基因突变，即P508L突变.【关键词】肾上腺白质营养不良；ALD基因；突变，误义；ALD卵白0弁言肾上腺脑白质营养不良(ALD,adrenleukdystrphy)是最常见的一种遗传性中枢神经髓鞘合成病变1.致病基因ALD基因位于X染色体，编码一个有745个氨基酸残基的过氧化物酶体膜卵白，即ALD卵白ALDprtein,ALDP.我们对1例肾上腺脑白质营养不良患儿及其家庭成员的ALD基因突变举行了阐发.1工具和要领12要领ALD基因的RNA长3.7k

3、b，此中编码区为2238bp.本研究合成4对引物2，即：PIF和RT1,PF和RT2,PF和RT3,PF和RT4，分4段自5端依次为ALD1,ALD2,ALD3,ALD4对ALD基因编码区举行扩增，预期巨细别离是722,700,723和646bp，此中ALD1的3端和ALD2的5端部门重叠，ALD2的3端和ALD3的5端部门重叠，ALD3的3端和ALD4的5端部门重叠.假设以PIF和RT4为引物对扩增ALD基因DNA，预期片断巨细是2440bp.引物托付上海生工Sangn生物工程公司合成.121长链RTPR及测序从患者取奇怪抗凝血1.53L，按Qiagen产物RNeasyiniKit说明书提取

4、总RNA.长链RTPR按TaKaRa试剂盒RNALAPRTKit说明书举行.先举行反转录，然后在PE2400型热循环仪上举行PR反响：94变性2in后，按9430s,6030s,722in循环30次.末了一个循环竣事后继承在72延伸8in.将上述PR混淆物1020L上样于15gL-1的琼脂糖凝胶电泳，切下含预期片断2440bp的胶块，利用Qiagen的DNA凝胶接纳试剂盒QIAquikGelExtratinkit从胶块中接纳DNA.以此DNA为模板，组配4个2次PR反响：反响体积50L，含模板1ng,引物各25pl,4种dNTP各0.2lL-1,Taq酶BiAsia2.5U,gl21.5lL-

5、1，别离扩增ALD1,ALD2,ALD3,ALD4，扩增条件同一为：94预变性2in后，按9430s,5030s,7260s举行1015个循环，末了一个循环竣事后继承在72延伸9in.用Qiagen的PR产物纯化试剂盒QIAquikPRPurifiatinKit直接从PR混淆液中纯化PR产物.将纯化的4个片断连同相应PR引物，寄上海博亚生物技能举行序列测定.122基因组DNA片断扩增和限定性内切酶阐发患者及其家庭成员的外周血基因组DNA利用Qiagen的DNA提取试剂盒QIAapDNABldiniKit提取.按照突变地点部位，用iga2.0软件方案针对外显子6全长序列的PR引物，上游引物(PA

6、5F)序列为：5TGGTTTGGGTA3，卑劣引物PA5R序列为：5AAGGTTTGGT3，预期扩增片断长330bp.扩增条件：95预变性4in后，按9430s,5530s,7230s举行30个循环.用Qiagen的PR产物纯化试剂盒QIAquikPRPurifiatinKit从PR混淆液中纯化PR产物.按照突变的性子，用限定性内切酶BspLIBIFerentas对纯化的PR产物举行酶切,于100gL-1聚丙烯酰胺凝胶上电泳,溴化乙啶染色后用美国BiRad公司的FlurS型凝胶成像仪网罗电泳效果.2效果21ALD基因RNA的RTPR扩增及测序用长链RTPR试剂盒对患者外周血ALD基因RNA的整

7、个编码区举行扩增，可得到预期的扩增片断2440bp，也可见一些非特异性片断.为进步特异性，并得到充足的PR产物，先从凝胶中接纳上述覆盖整个编码区的扩增产物，然后分4段ALD1,ALD2,ALD3,ALD4举行第2轮PR反响.2次PR产物的琼脂糖凝胶15gL-1电泳效果(Fig1)，14依次是ALD4,ALD3,ALD2和ALD1，4个片断均得到特异性扩增，其巨细与预期完全符合.直接用Qiagen试剂盒从2次PR混淆物中纯化ALD1,ALD2,ALD3,ALD44个片断后，用美国ABI公司的BigDye体系在377型测序仪上别离对其举行序列测定.正常比较(Fig2A)和患者(Fig2B)ALD3

8、片断部门序列，序列下划线处示产生突变的暗码子部位.效果表现，患者ALD基因RNA仅有一个碱基产生改变1523T，即第508个暗码子位于ALD3片断上产生了T的改变，使正常的脯氨酸被亮氨酸更换.正、反向测序效果同等.图1-图2(略)22限定性内切酶阐发以患者及其家庭成员的基因组DNA为模板，扩增突变地点的ALD基因第6外显子，扩增片断330bp.正常环境下，该片断内含有2个BspLI酶切位点GGNN，酶切后产生72,34和224bp3个片断.患者第508暗码子的T突变导致72与34bp片断之间的酶切位点消散，酶切效果产生106和224bp2个片断.酶切后的电泳效果(Fig3)，可以看出：患者父亲

9、和妹妹的酶切形式为正凡人形式含72,34和224bp3个片断，患者的酶切形式与预期符合含106和224bp两个片断，患者母亲的酶切图谱中既有106和224bp两个片断，也有72和34bp两个片断，为杂合子携带者.以上效果还颠末对330bp片断的直接序列测定证明.图3患者及其家庭成员ALD基因外显子6扩增产物的酶切阐发(略)3讨论本患者6岁起病，以举行性视力落落等中枢神经体系病症为主，病程希望敏捷1a内生长成双目失明，头部RI查出典范的大脑顶枕部长T1和长T2信号病灶，血浆极长链饱和脂肪酸浓度升高240/220比值超出参考范畴，切合儿童大脑型ALD的临床诊断1.ALD表示出高度的遗传异质性.按照

10、有关国际权力巨子数据库.xald.nl统计，如今在环球ALD患者中已断定出500多个ALD基因突变此中有一部门未颁发，仅在互联网上宣布，此中有一半以上仅见于单一家系.本病在临床表示方面表示型也是高度异质的，同一家属的差异患者在起病时间和临床病症上也每每不尽雷同3.表示型的异质性说明开展临床基因诊断的需要性，但遗传的高度异质性又使临床基因诊断的开展面对较大困难.我们曾报道在中国ALD患者创造的第1个基因突变2,4，本例P508L突变是在中国人群创造的第2个ALD基因突变.查阅国表里文献，尚未见有关此突变的报道.以下几点支持该突变是病理性突变的不雅点：患者的ALD基因的整个编码区只存在一个碱基改变

11、1523T，别的部门与正常比较的序列和GenBank参考序列N000033同等；患者父亲和妹妹的ALD基因不存在该突变，其母亲为携带者，与ALD作为X染色体隐性遗传病的特点切合；突变使ALDP的第508位氨基酸由Pr酿成另一个与之性子差异较大的Leu；突变所改变的氨基酸位于ALDP成效区ATP结合区守旧序列内5；1999年Takan等曾报道在紧邻的第507位氨基酸产生的一个突变，即G507V3.该突变详细怎样影响ALDP的布局和成效，有待进一步研究.以往ALD基因的突变阐发在技能上大多接纳通例RTPR要领：先合成DNA，然后分段对DNA举行扩增6.我们将新开拓的长链RTPR技能引入ALD基因的

12、突变阐发中：先扩增ALD基因RNA编码区全长，然后分段举行2次PR扩增.该技能途径简化了操纵，进步了重复性，淘汰了引物数.该技能途径在本研究的乐成应用，将为以后其他患者的基因诊断带来便当.【参考文献】1TangBS,LiHY.PrgressinthestudyfXlinkedadrenleukdystrphyJ.GuaiYixueShenjingbingxueShenjingaikexueFene(FrEignedSiSetNeurlNeursur),2001;28(3):185-188.2uYB,uYS,YangBS,LanFH.utatinalanalysisfahinesepatient

13、ithXlinkedadrenleukdystrphyJ.ShanghaiYixueJianyanZazhi(ShanghaiJedLabSi),2002;18(2):69-72.3TakanH,KikeR,ndera,SasakiR,TsujiS.utatinalanalysisandgentypephentyperrelatinf29unrelatedJapanesepatientsithXlinkedadrenleukdystrphyJ.ArhNeurl,1999;56(3):295-300.4LanFH.leulardiagnstisinhinaJ.linheLabed,2001;39(12):1190-1194.5RerigP,ayerhferP,HlzingerA,GrtnerJ.haraterizatinandfuntinalanalysisfthenuletidebindingf