微生物的生长及其控制课件

1、微生物的生长及其控制本章基本要求：掌握测定微生物生长繁殖的方法，掌握微生物的生长规律，了解影响微生物生长的主要理化因素，掌握控制有害微生物的主要方法。本章的重点是：影响微生物生长的主要理化因素、有害微生物的控制。本章的难点是：微生物的生长规律、有害微生物的控制。 第一节 测定生长繁殖的方法第二节 微生物的生长规律第三节 影响微生物生长的主要因素第四节 微生物培养法概论第五节 有害微生物的控制生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。几个的概念繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发

2、育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。个体生长个体繁殖 群体生长群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况测定生长繁殖的方法生长意味着原生质含量的增加，测定生长的方法都直接或间接地以此为依据。测定繁殖则是建立在计算个体数目的基础上。一、微生物的纯培养 稀释平板法 划线法 单细胞挑取法 选择培养基分离法二、测生长量三、计繁殖数计繁殖数直接法间

3、接法比例计数法血球计数法液体稀释法平板菌落计数法其它（P、DNA）测生长量直接法间接法测体积称重量（干重、湿重）比浊法生理指标法测含碳量测含氮量Viable cell count1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107cell No./ml2. plate out 0.1 ml 6Inoculating an agar plate to obtain single colonies6Mixed culturePure culture单细胞挑取法Mixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEa

4、ch colony was examined microscopically6选择培养基分离法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基6二、测生长量干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓度较高的样品。举例：液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。直接法7间接法比浊法：原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓

5、度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。7生理指标法测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。7各种型号的全自动血球计数仪三、计繁殖数比例计数法血球计数板法液体稀释法平板菌落

6、计数法滤膜培养法适于单细胞状态直接法血球计数板原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。血球计数板法适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小； （2）不易沉降。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。间接法平板菌落计数法液体稀释法薄膜过滤计数法平板菌落计数法的一般步骤 3.平板菌落计数法平板菌落计数法技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管

7、只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作4.液体稀释法10n10n-210n-1薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。第二节 微生物的生长规律由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（s

8、ynchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。一、微生物的个体生长和同步生长获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。Helmstetter-Cummings 法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；

9、除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。二、单细胞微生物的典型生长曲线定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。把少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的培养液中后，在适宜的条件下培养，如果以细胞数目的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以绘制出分批培养条件下微生物的生长曲线。典型的生长曲线 （Growth curve）延滞期对数期稳定期衰亡期将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作其它名称：停滞期、调

10、整期、适应期（一）延滞期（lag phase）1.现象：菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数= 0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物菌种 ：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；4.影响延滞期长短的因素：接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；培养基成分

11、：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。5.认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lag phase 的措施有：增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种；调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。选用繁殖快的菌种在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌（二）对数期（logarithmic phase）1.概念：指在生长曲线中，紧接这延滞期的一段细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直

12、线关系的时期。 又称指数期。2.特点：生长速率常数最大，即代时最短；细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致；代谢最旺盛；细胞对理化因素较敏感；指数期生长的数学模型繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)生长速率常数（R）代时（G）3.影响指数期微生物代时长短的因素：菌种：大肠杆菌 15 min；金黄色葡萄球菌30min; 结核分枝杆菌800 min ; 培养基成分：营养丰富代时短。同在37下培养，大肠杆菌 在牛奶中代时12.5 min，而在肉汤培养基中为17min.培养温度：温度对微生物的生长速率有明显影响。营养物浓度：一定浓度范围内影响生长速率和生长总量。营养物浓度对微生

13、物生长速率和产量8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子。4.应用意义：由于此时期的菌种比较健壮，是增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。又称：恒定期或最高生长期（三） 稳定期（stationary phase）1

14、.特点：生长速率常数为零：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。积累内含物：细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。开始合成次生代谢产物：对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。2.生长产量常数（Y，或生长得率，growth yield）：概念：表示微生物产量与营养物质的消耗之间有规律的比例关系。 Y=菌体干重/ 消耗营养物质的浓度Y=x x0C0 C=x x0C0根据生长产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。3.产生原

15、因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;4.应用意义：最佳收获时期：发酵生产形成次生代谢产物的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料）调pH 调整温度 促进了连续培养原理的提出和创建。（四） 衰亡期（decline phase）1.特点：2.产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。 “负生长”：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”；细胞形态多

16、样、内含物增多：细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；自溶现象：因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等；时间长：衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。（五）丝状菌的非典型生长曲线可分为三个时期：生长延滞期，快速生长期和生长衰退期。典型生长曲线与非典型的丝状菌生长曲线两者差别是：后者缺乏指数生长期，与此期相当的只是培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系的一段快速生长时期。三、连续培养（continuous culture）分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换

17、，最后一次性收获。连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养 恒浊法恒化法 单批培养连续培养时间连续流

18、入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养 连续培养方法连续培养器按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器单级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐连续培养器连续培养技术恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制

19、微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究恒化器Chemostat 或bactogen概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。连续培养技术恒浊培养原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。装置控制对象培养基培养基流速生长速

20、率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊器与恒化器的比较连续发酵（continuous fermentation）连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。四、微

21、生物的高密度培养微生物的高密度培养又称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。优点：提高产物的比生产率；减少培养容器的体积和培养基的消耗；提高下游工程中分离、提取的效率；缩短生产周期；减少设备投入；降低生产成本。河海大学第三节 影响微生物生长的主要因素微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它

22、有害的一面。影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营养因素之外，还有许多物理化学条件。 温度 氧气 辐射 干燥 渗透压 超声波与微波 酸、碱与pH 重金属及其化合物 表面消毒剂 有机化合物（酚类、醇类、醛类） 卤族元素及其化合物 表面活性剂（新洁尔灭、杜灭芬） 染料 抗代谢药物：磺胺类等 化学治疗剂 抗生素 中草药有效成分物理因素化学因素温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：一、温度影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸

23、收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。（一）微生物生长的三个温度基点超过最低生长温度时，微生物不生长。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为：(二)微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）低温型微

24、生物:最适生长温度在5-20,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据推测有两种原因：它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。 中温型微生物：最适生长温度为2040 ，大多数微生物属于此类。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要为寄生，在人和动物体内。高温型微生物：最适生长温度为50 60 ,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。在高温下能生长的原因：酶以及核糖体有较强的抗热性核

25、酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氢键，增加热稳定性 ）。细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。高温微生物的特点:生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。耐高温菌具应用优势：在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。菌 名生长温度发酵温度累积产物温度 （ ） （ ） （ ） Streptococcus thermophilus374737S.lactis3440产细胞：2530产乳酸：30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Cl

26、ostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。分段控制方式：05小时，30 ；540小时，25 ；40125小时，20 ；125165小时，25 。不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以， 最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。微生物对热的耐受力与以下因素有关:（三）高温与低温对微生物的影响(1)微生物种类及发育

27、阶段 嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热(2)微生物对热的耐受力还受环境条件的影响 与培养基的营养成分有关培养基中蛋白质含量高时比较耐热.与pH 有关 pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡.与水分有关含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡.与含菌量有关 含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。与热处理时间有关热处理时间长，微生物易死亡。当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。2、低温

28、对微生物的影响低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。造成死亡的原因：冻结过程造成细胞脱水。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。微生物耐热性大小的几种表示方法： 热力致死时间：在特定的温度及其它条件下，杀死

29、一定数量的微生物所需要的时间 F值：在一定的基质中，温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需的时间. D 值：利用一定温度进行加热，活菌数减少一个对数周期（即90%活菌被杀死）所需的时间. Z值：在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需要升高的温度灭菌与消毒的概念： 灭菌是指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施；消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体中病原微生物的措施.加热灭菌和加热消毒的方法： 干热灭菌法 火焰灭菌法 干燥加热空气灭菌法高温灭菌 巴氏消毒法 常压下 煮沸消毒法 湿热灭菌法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加

30、压下 (高压蒸汽灭菌法) 连续加压灭菌法影响加压蒸汽灭菌效果的因素灭菌物体的含菌量灭菌锅内空气的排除程度灭菌物体的pH值灭菌对象的体积加热与散热的速度高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响： 形成沉淀物（有机沉淀物如多肽类，无机沉淀物如磷酸盐）；破坏营养；提高色泽（褐变如产生氨基糖等）；改变培养基的pH值；降低培养基的浓度消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法 加入螯合剂 微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:二、氧气氧浓度对不同微生物生长的影响专性好氧菌（strict aerobe）必须在有分子氧的条件下才能生

31、长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。兼性厌氧菌（facultative aerobe）微好氧菌（microaerophilic bacteria）只能在较低的氧分压下(0.01-0.03)才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。耐氧菌（aerotolerant anaerobe）可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依

32、靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。厌氧菌（anaerobe）分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2 ）等

33、。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。各类菌所含对氧解毒酶专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶H2O + O22 O2 + 2H+O2 + H2O22H2OO2 + eO2 ( O2 )超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的

34、一种自我保护方式。兼性厌氧菌E.coli在发生SOD缺失突变后，就会变成一种“严格厌氧菌”。生物体中超氧阴离子的形成与去除12SOD好氧生物和耐氧细菌过氧化氢酶 好氧生物过氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。三、pH（一）环境pH值对微生物生长的影响改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵

35、母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。（二) 不同微生物对pH要求不同微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但绝大多数种类都生活在pH5.0-9.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸

36、微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌 微生物种类最低pH最适pH最高pH大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌黑曲霉一般放线菌一般酵母菌 4.3 4.5 4.2 1.5 5.0 3.06.08.06.07.57.07.55.06.07.08.05.06.0 9.5 8.5 9.3 9.0 10 8.0 一些微生物生长的pH值范围同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要，举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸

37、为主. 微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.36.96.77.3红霉素链霉菌6.67.06.87.3产黄青霉6.57.26.26.8金霉素链霉菌6.16.65.96.3龟裂链霉菌6.06.65.86.1灰黄青霉6.47.06.26.5生长的最适pH值与发酵的最适pH值同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=23时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物

38、以草酸为主，只产少量柠檬酸。（三）微生物细胞内的pH值虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。（四）微生物的生命活动对环境pH值的影响微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：由于有机物分解：分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收：铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH

39、硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)， pH培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。NH4+被吸收NO3+被吸收配制培养基时调整pH值的措施：（五）酸碱添加剂的抑菌机理无机酸：与H+浓度成正比的高氢离子浓度，可引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏酶类的活性有机酸：与不电离的部分成正比,故有时有机酸的抑菌效果无机酸。作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长。碱类物质：强碱可引起蛋白质、核酸大分子变性、水解，以杀死或抑制微生物。食品工业中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作为机

40、器、工具以及冷藏库的消毒剂。几种常用表面消毒剂及其应用表面消毒剂：对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内化学治疗用的化学药剂类型名称及使用浓度作用机制应用范围重金属盐0.05-0.1%升汞 0.1-1%AgNO3使蛋白质变性非金属物品，器皿皮肤，滴新生儿眼睛酚类3-5%石炭酸2%煤酚皂（来苏儿）蛋白质变性，损伤细胞膜地面、家具、器皿皮肤醇类70-75%乙醇蛋白变性、脱水、溶脂皮肤、器械醛类0.5-10%甲醛蛋白质变性物品消毒、接种室熏蒸氧化剂0.1%KMnO4蛋白质变性皮肤、尿道、水果蔬菜卤素及其化合物0.2-0.5mg/L氯气10-20%漂白粉0.5-1%漂白粉2.5%碘酒破坏细胞膜、酶、蛋

41、白质蛋白质变性饮水、游泳池水地面、厕所饮水、空气、体表皮肤表面活性剂0.05-0.1%新洁尔灭破坏膜及蛋白质、皮肤、黏膜、手术器械染料2-4%龙胆紫蛋白质变性皮肤、伤口四 辐射不同波长的射线对微生物的作用不同，可见光部分（400-800纳米）往往能被某些光合微生物所利用，而波长较短的紫外线（13.6-400纳米）、X-射线（0.06-13.6纳米）、r-射线（0.01-0.14纳米）均可抑制甚至杀死微生物。尤其是r-射线因作用距离较远、穿透力较强而用于食品的杀菌保藏。物理杀菌：一类新的冷杀菌技术，它在克服热杀菌不足之处的基础上，运用物理手段如电场、高压、电子、光等的单一或两种以上的共同作用，在

42、低温或常温下达到杀菌的目的。这种方法不须向食品中加入化学物质，不会使菌体产生抗性，且条件易于控制，在保持食品自然风味的基础上，杀菌效果明显。常用的物理杀菌的方法有超高压脉冲电场杀菌、脉冲强光杀菌、半导体光催化杀菌，辐射杀菌。五 干燥（湿度）水分约占微生物细胞组成的70-85%，环境中缺水时（干燥的环境）引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类浓度的增高，抑制微生物的生长，甚至造成微生物的死亡。干燥对微生物的作用受环境温度、失水速度、菌龄、微生物所处基质等条件的影响。干燥用于食品保藏的方法可分为两类，即自然干燥（熏干、晒干、冷冻干燥）和人工干燥（常压干燥如热风、喷雾、冻结、微波等；真空干燥如真空和冷冻

43、真空干燥）六 渗透压微生物生长与渗透压的关系（高渗透压、低渗透压对微生物生长的影响）根据微生物对高渗透压耐性的不同，将其分为以下三类 高度嗜盐细菌（20-30%食盐溶液中生长） 嗜盐细菌 中等嗜盐细菌（5-18%的食盐溶液中生长） 低嗜盐细菌（2-5%的食盐溶液中生长） 耐盐细菌（可在10%以下的食盐溶液中生长） 耐糖细菌（可在60%以下的含糖高渗溶液中生长）* 普通微生物一般在0.85-0.90的食盐溶液中生长河海大学第四节 微生物培养法概论培养微生物是研究和应用微生物的基础。一个良好的微生物培养装置的基本条件：按微生物的生长规律进行科学的设计，在能提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物

44、获得适宜的温度和良好的通气条件（厌氧菌除外），为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染。微生物培养技术的发展少量大规模浅深固体液体静动单批连续游离固定化从微生物到动植物细胞野生菌工程菌单菌混菌低密度高密度人工自动一、实验室培养法（一）固体培养法1、好氧菌的固体培养法：试管斜面、琼脂平板等。2、厌氧菌的固体培养：需要特殊的培养装置或器皿，要配制特殊的培养基，加入适当的还原剂，必要时要加入刃天青等氧化还原势指示剂。具体培养方法有：高层琼脂柱、厌氧培养皿、亨盖特滚管技术、厌氧罐和厌氧培养箱。（二）液体培养法1、好氧菌的液体培养：氧的供应是好氧菌生长、繁殖的限制因子。在培养中要保持培养液较高

45、的溶解氧浓度。具体培养方法有：试管液体培养、三角瓶浅层液体培养、摇瓶培养和台式发酵罐等。2、厌氧菌的液体培养：厌氧罐或厌氧培养箱培养；好氧环境中加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C等有机还原剂或铁丝等无机还原剂，在培养基上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油。Brewer 皿.高层琼脂柱亨盖特技术Anaerobic Glove Box厌氧手套箱Batch & Continuous culture1 L - 1000L二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法1、好氧菌的曲法培养：原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄地铺在培养容器表面，使微生物即可获得充足的扬弃，又有利

46、于散发热量，还十分有利于真菌产生孢子。根据制曲容器的形状和生产规模的大小，可把制曲方法分成瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲和通风曲等。通风曲是一种机械化程度和生产效率都很高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业中广泛应用。2、厌氧菌的堆积培养法生产实践上对厌氧菌进行大规模固态培养的例子还不多见。我国的传统白酒生产中，采用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利，因此可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。（二）液体培养法1、好氧菌的培养浅盘培养深层液体通气培养：发酵罐通风曲槽结构模式图 1.天窗，2.曲室，3.风道，4.曲槽，5.曲料，6.篦架，7.

47、鼓风机，8.电动机 机械搅拌通风发酵罐的构造及其运转原理 好氧菌的曲法培养酒曲的分类现代大致将酒曲分为五大类，分别用于不同的酒。它们是： 麦曲，主要用于黄酒的酿造；小曲，主要用于黄酒和小曲白酒的酿造；红曲，主要用于红曲酒（黄酒的一个品种）的酿造；大曲，用于蒸馏酒的酿造。麸曲，这是现代才发展起来的，用纯种霉菌接种以麸皮 为原料的培养物。可用于代替部分大曲或小曲。目前麸曲法白酒是我国白酒生产的主要操作法之一。其白酒产量占总产量的70%以上。 挂曲大曲的一种小曲红曲近代人工踏制大曲A whole process of DA-QU prepation用米粉制成 用蒸熟的米饭制成 第五节 有害微生物的控

48、制广东海洋大学一、几个基本概念灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、

49、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。 二、消毒灭菌火焰灼烧法烘箱热空气灭菌法干热灭菌法巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法高温灭菌（消毒）法（一）消毒灭菌的种类湿热灭菌（消毒）法连消法高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 10 min可以致死。一般噬菌体6580 致死， 放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，7680 10min可以杀死细菌芽孢，在120 下20min才能致死， 嗜热脂肪芽孢杆菌可在80 条件下生活，在120 ，12min才能杀死。同种微生物老龄菌比幼菌耐热。 干热灭菌法（dry heat sterilization）焚烧法（incine

50、ration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。常用于废弃物、动物尸体等处理.干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。湿热法(moist heat sterilization) ：特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因： 1) 菌体内

51、含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。种类：巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法、高压蒸汽灭菌法和连消法。高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、

52、氨基酸等培养基用112 。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水物品。 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅注意事项：排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。间歇灭菌法：方法：将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。应用：适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、一些药品的灭菌。缺点：麻烦、费时。煮沸消毒法将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死

53、所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒的目的。如饮用水，一些金属器械。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒.该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。如牛奶、啤酒。低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶高温瞬时法（High temperature short time, HTST): 71.615s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至

54、75，经匀质化后冷却至20。连消法（continuous autoclaving）：也叫连续加压蒸气灭菌法方法：让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。培养基一般加热至135140 下维持515s。优点： 1)彻底灭菌，同时有效减少了营养成分的破坏，提高了原料的利用率和发酵产品的质量和产量； 2)缩短了灭菌时间，提高了发酵罐的利用率； 3)蒸气负荷均衡，提高了锅炉利用效率； 4)适宜自动化操作。应用：大型发酵厂的大批培养基灭菌。利用温度进行杀菌的定量指标有热死时间：指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。例如，E. coli在60下为10min，Sal

55、monella typhi在58下为30min。热死温度：又称热死点，指在一定时间内（一般为10min）杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。如根瘤土壤杆菌为53 。（二）影响加压蒸气灭菌效果的因素1、灭菌物体含菌量2、灭菌锅内空气排除程度3、灭菌对象的pH：pH在6.08.0时微生物不易死亡4、灭菌对象的体积：影响热传导速率和热容量5、加热与散热速度（三）高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响：会产生混浊或形成不溶性沉淀营养成分被破坏（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；改变培养基的pH值（通常下降0.2） ；形成有害物质，抑制微生

56、物生长；消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法 加入螯合剂、气体灭菌剂（环氧乙烷）过滤作用过滤作用紫外线（非电离辐射）杀菌机制： 诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制辐射 低温：利用4以下的各种低温以保藏食物、药品、菌种等。缺氧：在密闭容器中加入除氧剂，如铁粉。真空保藏也是比较常用的方法。干燥：采用晒干或红外线干燥保藏粮食、食品等，或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用。高渗：通过盐渍或糖渍达到高渗。高酸度：如泡菜、酸菜等。防腐剂：苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸等三、防腐的措施控制微生物的化学物质(因素)四、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂（一）表面消毒剂抗代谢物抗生素（二）化学

57、治疗剂溶液状态气体状态生物药物素评价抗菌化学物质的药效和毒性时，经常使用以下3种指标：最低抑制浓度（MIC）：在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度；半致死剂量（LD50）：在一定条件下，某化学药剂能杀死50%试验动物时的剂量；最低致死剂量（MLD）：在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100%死亡的最低剂量。消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物；不能用作活细胞或机体治疗用的化学药剂。防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂.用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料、药品的防腐作用。但现时消毒剂和防腐剂界限并不很严格.（一）消毒剂和防腐剂消毒防腐剂的作用机理一般有下列三种方式:使微生物蛋白质凝固变性,发生沉淀.如酒精等.破坏菌体的酶系统,影响菌体代谢.如过氧化氢等.降低微生物表面张力,增加细胞膜的通透性,使细胞发生破裂或溶解.如来苏儿等酚类物质.种类：酸和碱 ；重金属及其盐类；氧化剂；有机化合物；卤素及化合物；染色剂；表面活性剂。 类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围醇类70%75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿醛类0.5%10%甲醛2%戊二醛