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文档简介
1、关于实验蛋白质标准曲线的制作第一张,PPT共十三页,创作于2022年6月一、实验目的学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法第二张,PPT共十三页,创作于2022年6月二、实验原理一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。第三张,PPT共十三页,创作于2022年6月考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(B
2、eers law)。此染料与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残结合,通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外,反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色,单体和聚集体共存时表现为绿色,全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。第四张,PPT共十三页,创作于2022年6月第五张,PPT共十三页,创作于2022年6月蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h,之后,蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。第六张,PPT共十三页,创作
3、于2022年6月三、实验仪器和试剂(一)试剂1. 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G250 100mg溶于50mL 95%乙醇,加入100mL 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4。2. 标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白(BSA),预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。第七张,PPT共十三页,创作于2022年6月(二)器材721型分光光度计、移液管(1mL,5mL)、试管及试管架第八张,PPT共十三页,创作于2
4、022年6月四、实验步骤试管编号0123451mg/mL标准蛋白(mL)00.20.40.60.810.15mol/L NaCl (mL)10.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂 (mL)555555充分摇匀,20min内以0号管为空白对照,在595nm测定A595nm第九张,PPT共十三页,创作于2022年6月以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为200g、400 g、600g、800 g、1000 g),在坐标轴上绘制标准曲线。1. 利用标准曲线查出回归方程。2. 用Excel作图,测出回归线性方程。即A595nm=aX。相关系数一般大于0.9。3. 未知样品蛋白质浓度的
5、测定:第十张,PPT共十三页,创作于2022年6月测定方法同上,取合适体积的未知样品(奶粉,1g奶粉溶于30mL 0.15mol/L NaCl,3000rpm离心5分钟,取上清待用 ),使其测定值在标准曲线的直线范围内(01000g),根据所测定的A595nm,利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量(g),从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。一般被测样品的A595nm值在0.10.5之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以减少取样量,如果仍然很大,可以定量稀释后再进行测定。第十一张,PPT共十三页,创作于2022年6月五、注意事项:(一)蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合
6、的反应十分迅速,在2min左右反应达到平衡;其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的520min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。(二)测定中,蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。1Bradford法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子,如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3测定时仅使用一套比色杯(2个),并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯,仅用待测液润洗23次即可。另外,还要注意,玻璃仪器要洗涤干净并保
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