在花青素生物合成调控机制中土豆StAN11Gene的克隆和特征(共15页)

1、在花青素生物合成调控(dio kn)机制中土豆StAN11 蛋白(dnbi) 基因(jyn)的克隆和特征摘要：花青素是植物次生代谢的一类产物，决定着土豆块茎的颜色，花青素的生物合成是一个复杂的生物过程，涉及了大量的基因，包括结构基因和调控基因，在此次研究中，从Chieftain土豆品种中克隆来的一个WD40重复蛋白基因StAN11,。StAN11 (HQ599506) 不包括内含子，开放阅读框为1029bp，编码342个AA的蛋白质，为了查证它在花青素合成中的作用，StAN11被导入CaMV35S启动子的pCMBIA1304后面，然后再合成的载体利用农杆菌转化法被引入到 Dsir品种中，与野生

2、品种的空白对照相比，转基因块茎的颜色大大的加深了，这这种颜色的加深与花青素的积累和StAN11 的表达保持着高度的一致。进一步对转基因植物黄铜-3-羟化酶， HYPERLINK /link?url=/indu/226/2255142A3F2.htm&q=Dihydroflavonol+reductase&ts=1444396230&t=087604d157b16cb02cf27bb092b86c9&src=haosou t /_blank 二氢黄酮醇还原酶(DFR),花青素合酶（ANS）,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶的表达进行分析，发现了只有DFR是增高的，这说明StAN11是通过控制DFR的

3、表达来调控花青素的合成的，以花青素生物合成作为遗传背景，块茎中StAN11的过表达和可以提高花青素的积累。关键词： 花青素生物合成，克隆基因转录，土豆，StAN11引言花青素是从植物中提取的黄酮类色素，决定着植物的颜色，在植物抵抗非生物和生物逆境中起作用，吸引昆虫授粉，提高种子的传播效率，它的高抗氧化性常常用于抗癌变，抗诱变，抗菌，抗炎症，抗动脉粥样硬化。 由结构基因编码的大量酶对花青素的生物合成起重要作用，已经发现的有三种转录调节因子在花青素的合成中，分别是 R2R3MYB, basic helixloophelix (bHLH), and WD40repeat (WDR)proteins，

4、这些转录蛋白的结合和相互作用决定这下游基因的表达，在拟南芥中，花青素的生物合成主要是通过三元配合物活化DFR和LDOX(无色花青素双加氧酶)结构基因来调节，蓝光诱导花青素的积累，在拟南芥种子发育中茉莉酮酸酯也由 WDrepeat/Myb/bHLH 转录复合物来调节，在土豆中，MYB转录因子 StMtf1 和StAN2很好的被分离出来了，并且证明了它们在花青素的生物合成中起调控作用。近些年与花青素合成(hchng)有关的WD40repeat 转录因子在拟南芥玉米，矮牵牛花，金鱼草中很好的表达出来了，并且(bngqi)包含了一个特殊的高度保守(boshu)的 tryasp（WD）repeat ，但

5、是没有固定的酶和转录因子的活性.在拟南芥中，TTG1编码的WD40repeat蛋白被证实涉及MBW复合体的结构和稳定性，在突变体ttg1缺乏花青素的时候MBW复合体控制着花青素的合成和表皮毛和根毛的结构。这个基因的同源染色体已经在其他植物中被鉴定了， 矮牵牛花杂种的AN11 ，玉米的PAC1 ,紫罗兰的MtWD401 。 WDR可以提高bHLH 在紫麻 Perilla frutescens中的核定位，可能与MYB的翻译后调控有关，液泡PH的控制，and 种皮表皮的形态学特征在P. Hybrid中，大多数分离的WDrepeat的蛋白在花青素的合成中是必须的。彩色土豆包含大量的花青素，并且是公认的

6、有利于人身体健康的抗氧化剂的重要的来源，随着花青素高含量土豆价值的增加和生物技术的发展，代谢工程学通过过表达调节基因来获得新的土豆品种是一个广泛应用的方法， Jung的研究说明了在土豆中过表达调节了 StAN2基因，可以提高土豆块茎中花青素的含量，编码 WD40重复蛋白的基因AN11，第一次是在矮牵牛花杂种中发现的，但是并没有在土豆中报道过。在这篇报道中 StAN11从土豆变种Chieftain中分理出来，它的作用通过土豆变种Dsire中基因过表达来分析。结论StAN11是与花青素合成途径有关的调节基因的同系物 StAN11 的全部CDNA是利用一对特殊引物通过基因的折叠来获得的，两个 1,1

7、00bp的片段分别是由土豆cDNA和基因组DNA扩展来的,这些序列被存放在 GenBank。StAN11包括1029bp的开放阅读框，编码342个AA，分子质量为32KDa,等电点为4.95，通过对cDNA和DNA的比较发现StAN11没有内含子， 通过将StAN11蛋白质序列与来自GenBank和EMBL数据库的植物(zhw)的序列相比发现它有一段重要的序列与NcWDR(93.86%),PhAN11 (88.63%), MdTTG1 (83.33%), and VvWD40 (80.70%)相似(Figure 1A)。这些基因(jyn)都参与了花青素合成。对 StAN11 protein 保

8、守序列的分析发现它包括4中WDrepeat基序(theAA residuesare at 67112, 117162, 165203, and 254294)，和40个以 TrpAsp结尾(jiwi)的AA(Figure 1B),在三维结构中, StAN11蛋白包括11条多肽链和9个贝塔发夹。(Figure 1C).其次(qc)，用StAN11构造(guzo)的系统(xtng)发生树是，它的同系蛋白质来自GenBank的12个物种， StAN11蛋白聚合在一个来自葡萄的VvWDR1分化枝上和群体中。 StAN11蛋白的组织表达模式为了研究StAN11蛋白的组织表达模式，StAN11蛋白中的mR

9、NA在Chieftai变种的不同的组织中被测定，方法采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术，在图表3中，StAN11转录物在所有组织中被检测到，在块茎中是高水平，在根中是低水平。1, root; 2, stem; 3, leaf; 4, bud; 5, stolon; 6, mature tuber.StAN11 转基因植物(zhw)的生产 在转化(zhunhu)过程中，重组(zhn z)载体 pCMBIA1304StAN11的表达 (Figure 4A)，利用PCR检测(Figure 4B)，Dsire利用根瘤农杆菌作为中介进行转化，转基因植物的再生在图C，在转染了农杆菌后，愈伤组

10、织诱导出茎用了两周，诱导出根用了四周，在根长到2-3cm的时候利用Hyg B选择培养基进行选育，存活的根种植在温室里。 共获得了17个存活的株系，利用PCR对其进行转基因插入，其中6个株系达到了预期的837bp的扩增条带，在Dsire 对照组中未发现扩增条带(Figure 5A)。为了得知StAN11是否在PCR检测的阳性植株中表达，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术处理土豆叶片，StAN11的转录水平在转基因植物中要明显高于对照组中的(Figure 5B)。结果显示StAN11成功的在6个株系中过表达了。StAN11的过表达(biod)提高了花青素的积累在转基因土豆(tdu)茎

11、的表皮(biop)中在转基因土豆生长50天后，茎的颜色与野生的品种相比明显不同，前一个是紫色的，后一个是亮红的，为了辨清茎的颜色和花青素的联系，测定了茎表皮花青素的的含量，结果表明在所有转基因株系中花青素的含量要高于空白对照，大约2-6倍，我们进一步测定了StAN11在转基因植株的表达水平，qRT-PCR技术测定 StAN11的表达在转基因植株中以不同水平的增加了，与这些转基因株系中花青素含量是一致的。结果显示在转基因土豆茎的表皮中StAN11的过表达提高了花青素的积累。StAN11调控(dio kn)StDFR在土豆(tdu)中的表达(biod)为了证明StAN11作为一个调节基因在花青素的

12、合成中是如何调控结构基因的，我们利用了半定量逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术测定了转基因植株2的StF3H,StDFR,StANS,andSt3GT蛋白在叶片和茎中的表达，结果显示与野生品种相比StDFR在转基因株系中显著增加了，但是StF3H,St3GT, and StANS变化不显著。表明StDFR是StAN11在花青素合成中的靶蛋白。DISCUSSION近些年，由于(yuy)花青素对人体健康(jinkng)的作用，高含量花青素的彩色(cis)土豆越来越受欢迎。彩色土豆的繁殖的需求促进了花青素生物合成机制的研究，随着检测出花青素生物合成中的结构基因，一些调节基因像StAN1b (JX

13、848660) and StAN2被分离出来，这两个基因分别属于bHLHandMYB(转录因子的DNA结合域)。在这篇报道中，我们从Chieftain变种中克隆了与花青素生物合成有关的调节基因StAN11，属于WD40基因家族。一些基因标记蛋白表现了高序列一致性，与葡萄品种VvWDR1是近亲关系。 在花青素合成中，WD40蛋白有利于MYB and bHLH中调节因子的蛋白质和蛋白质的相互作用，这些蛋白有典型特征的WD40模序，一个以TrpAsp结尾的含40个AA的序列。在WD40蛋白中基序是一个串联的重复单位，至少四个WD40重复蛋白组成一个高阶和高功能的结构，在这研究中，StAN11包括4个

14、WD40基序，与其他物种中WD40蛋白在结构中保持一致。 AN11的表达通常是在特殊组织中，像出现在拟南芥的花芽中，苹果中的果实中，StAN11转录产物在可以在Chieftain所有组织中检测得到，但是高水平的表达在花芽和茎中，这些特异性表达可能与与基因的功能位点有关。花青素合成(hchng)的调节基因的异常(ychng)表达在多种植物(zhw)中发现，比如在拟南芥中，转基因葡萄的VvWDR1和苹果的MdTTG1基因的表达增加了花青素的含量，土豆中转基因植株Dsire的StAN2的过表达加深了茎的颜色，在这篇研究中，在转基因株系中，StAN11的过表达有效的增加了花青素的含量，实验结果表明St

15、AN11在花青素的合成中起了重要的作用。在转基因植株中常常发现一些变种，可能是由于导入复制的数目，合成的位置，以及转基因的沉默导致的，在四种转基因的株系中，花青素的含量相当的不同。这些不同与转基因植株中的StAN11的表达的不同完全符合。为了证实StAN11在花青素合成过程中的调节机制，为了证明 StAN11作为一个调节基因在花青素的合成中是如何调控结构基因的，我们利用了半定量逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术测定了转基因植株2的StF3H,StDFR,StANS,andSt3GT蛋白在叶片和茎中的表达，结果显示StDFR在转基因株系中显著增加，StAN11是你通过调节StDFR的表达来调

16、节花青素的合成的，进一步证实了在拟南芥中DFR是MYB/WD40/bHLH调控复合物的靶蛋白。总结(zngji)，我们(w men)利用(lyng)RTPCR从土豆变种中克隆了一个WD40重复蛋白的基因StAN11，结果表明StAN11与花青素的生物合成的调控有关，结构基因StDFR是他的靶蛋白（靶点），这个研究为花青素含量提高的应用提供了证据，同样提高了我们的能力去发现新的生物技术方法来利用分子基因的方法繁殖高花青素含量的土豆新品种。MATERIALS AND METHODS将在试管中生长的土豆块茎在温室中种植，自然光照射，一个月后幼叶提取RNA和DNA，两个月后根、茎、叶、芽和块茎用于St

17、AN11空间表达的分析。组织培养得来的土豆变种Dsire的组培苗在24恒温箱中12h/12h日夜交替培养。组培苗培养四周的茎段作为转化实验的外植体。StAN11 cDNA and 基因组DNA的提取0.1g 的Chieftain叶片用总RNA提取试剂提取其总RNA，在此之前用DNase处理，1%的琼脂糖凝胶电泳来确定RNA的完整性，260nm的吸收波峰来测定RNA的浓度，纯度的测定用A260/A280来衡量。cDNA的第一条链由MMLV反转录酶从Promega中合成。PCR：cDNA 1ul1*Taq 反应 buffer2.5mMMgcl2，250nM d NTP，1mM引物，2.5U Taq

18、酶StAN11的cDNA由正向引物(5TCAAAATGGAGAATTCAAGTC3) 和反向引物 (5 TCTTACAGGAAAAATTC AATCAT3 )扩增来的，这些引物根据PhAN11(U94748),NcWDR (GQ260131), and InWD40 (AB232779)cDNA序列设计来的。扩增的程序：945min,9435个循环40秒，5240秒，721min,7210min最终延伸。总基因组DNA从土豆(tdu)的幼叶中利用(lyng)CTAB法提取(tq)，StAN11 DNA序列直接利用特异性引物从总DNA中PCR得来，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳来分离，在回收的

19、凝胶中获得目的DNA条带，然后被克隆进pMD19T载体，然后被转入大肠杆菌DH5a菌株完整的细胞中，白色菌落利用PCR检测，阳性克隆被测序。StAN11的序列分析将StAN11提交到NCBI中用BLASTP（数据库中蛋白质序列比较）进行序列比较分析，利用DNAMAN程序进行大量的序列对比和进化分析，利用SMART对保守区段进行分析，用瑞士模式服务器进行蛋白质三维结构的分析，AN11蛋白的进化树用利用MEGAv 4.1通过neighborjoining (NJ)方法构造。系统树 各分支的置信度用自展检验法（bootstrap test）检验，共进行1000次循环StAN11的组织表达分析从变种C

20、hieftain提取根茎叶芽块茎的RNA ，并且加入NDase，cDNA 的第一条链利用MMLV反转录酶，StAN11 cDNA的反转录区域利用AN11S and AN11A引物扩增，用引物GAPDHS(5TCAACGAGAATGAATACAAGCCA3 and GAPDHA (5TCGA-CAACA GA AACATCAGCAGT3 )扩增的350bp的片段作为RNA的模板，这些引物是利用StGAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）设计的。扩增的程序：945min,9435个循环40秒，5240秒，721min,7210min最终延伸。PCR共扩增28个循环。pCMBIA1304StAN11载体

21、(zit)的结构用正向(zhn xin)引物(5CATGCCATGGAAAATTCAAGTCAAG3限制(xinzh)酶切位点)和反向引物(5GAAGATCTTCTTACAG-GAAAAATTCAATCAT3)PCR扩增StAN11的ORF.。PCR产物通过测序被确定然后导入pCMBIA1304中，在35S启动子后面，重组载体pCMBIA1304StAN11利用反复冻融法导入到农杆菌Agrobacterium 菌株GV3101中。Potato 转录and繁殖将四周的土豆幼苗的0.5-1.0cm的块茎在Y2培养基（MS+mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2mg/L-萘乙酸+0.2mg/L2.4-二氯

22、苯氧基乙酸）上，在黑暗环境中24预培养2d，然后浸入到携带pCMBIA1304StAN11质粒的农杆菌（光密度OD600=0.6）中悬浮8min，然后在Y2培养基上共培养2d与之前同样的环境，然后被感染的块茎放置在MGT培养基上（MS+0.03mg/L赤霉酸+0.5mg/LN-苯基-N-1.2.3-噻二唑-5-脲+200mg/L头孢噻扝+10mg/L潮霉素B），在光周期12/12,24的环境中诱导愈伤组织，四周后从茎段中获得再生嫩枝，放在MS培养基中培养，培养基中加入10mg/L潮霉素B，检测生根，存活下来的植株放在温室中培养。PCR identification of transgenic

23、plants为了(wi le)鉴定(jindng)转基因植株，从在HygB培养(piyng)基存活的植株和野生品种Dsire中的叶中提取基因组DNA，转基因土豆株系利用PCR来鉴定，扩增的程序：945min,9435个循环40秒，5240秒，721min,7210min最终延伸。PCR共扩增28个循环。引物(5TTGCCATTGCGTTTTCTAAC3)and(5TCACGGGTTGGGGTTTCTAC3 )。PCR产物预计得到的837bp个片段，包括pCAM-BIA1304载体和 StAN11的ORF的重要序列。 qRTPCR analysis of StAN11 expression利用半定量PCR来检测StAN11的转录水平，在培养了50天的空白对照和转基因植株的茎表皮提取总RNA，并且用DNase处理.CDNA的第一条链合成，延伸因子StEF1a基因用于内部调控，利用引物 (5AGTTTTTGCGTCCGTTTCTG3 ) andreverseprimer(5