组织学制片技术（本科）

1、组织病理学常用技术基本理论第2节、第3节2021/4/261目的要求1、了解组织学制片的基本程序；2、熟悉HE染色的步骤；3、掌握HE染色结果的观察。2021/4/262第二节 组织学常用的几种标本类型见视频“组织学制片方法”2021/4/2631切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常用的标本。第二节 组织学常用的几种标本类型2021/4/2642铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载玻片上，经固定、染色、封固而制成的标本。2021/4/2653涂片标本：主要是将液态组织如血液、骨髓、痰液、腹水、精液等液体涂抹于载玻片上，经

2、固定、染色制成的组织标本，以供观察细胞的形态与其微细结构。2021/4/2664磨片标本：不经脱钙及切片手续，而直接用手工在磨石上磨制成薄片，以便在显微镜下观察的骨、牙磨片标本。2021/4/2675分离标本：将极小组织块用化学药物的水溶液浸泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行镜检。2021/4/2686压片标本：组织经化学药物软化及染色后，用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动终板的制作。2021/4/2697整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小动物、胚胎或病变器官

3、经固定后，保存于固定液中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。2021/4/26109、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022/7/232022/7/23Saturday, July 23, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/232022/7/232022/7/237/23/2022 8:27:13 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/232022/7/232022/7/23Jul-2223-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/232022/7/232022/7/23Saturday, July 23,

4、 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/232022/7/232022/7/232022/7/237/23/202214、抱最大的希望，作最大的努力。23 七月 20222022/7/232022/7/232022/7/2315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/232022/7/232022/7/237/23/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/232022/7/2323 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/232022/7/232022/7/232022/7/238活体标本：如将蛙的

5、口腔粘膜取下放于载玻片上，迅速滴加生理盐水或Ringer氏液以观察其纤毛运动。其它如精子运动亦可按此方法进行观察。2021/4/26129、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022/7/232022/7/23Saturday, July 23, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/232022/7/232022/7/237/23/2022 8:27:13 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/232022/7/232022/7/23Jul-2223-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/232022/7/232022/7/23Saturday, Ju

6、ly 23, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/232022/7/232022/7/232022/7/237/23/202214、抱最大的希望，作最大的努力。23 七月 20222022/7/232022/7/232022/7/2315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/232022/7/232022/7/237/23/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/232022/7/2323 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/232022/7/232022/7/232022/7/239血管注

7、射标本： 一种是将树脂类铸形剂经血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与所支配组织或器官的相互关系。2021/4/2614 组织切片的制作方法有：石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、明胶切片、振动切片、塑料切片（半薄切片）、超薄切片（电镜标本）、碳蜡切片等。石蜡切片是最常用的方法，本节将较详细讲授其制作步骤。 第三节 组织切片的常规制作（一） 概述2021/4/2615 组织切片制作方法的基本程序：

8、取材固定脱水透明包埋切片染色封固。2021/4/26162021/4/2617（1） 断头法：（2） 麻醉法：（3） 空气栓塞法：（二）动物的致死与取材1、动物致死法： 2021/4/2618(1) 所取材料越新鲜越好；(2) 切取组织的刀剪刃口必须锋利 ；(3) 取材时必须考虑切面的方向 ；(4) 组织块应力求小而薄 ；(5) 收缩较大的新鲜组织 ；(6) 注意清洁 ；(7) 用作免疫组化的组织取材 ；(8) 病理取材 。2、组织取材时应注意：2021/4/2619粘膜粘膜下层肌层浆膜胃壁结构模式图2021/4/2620使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，防止组织自溶；使组织

9、成份转变为不溶性物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。（三）标本的固定1固定的目的2021/4/2621(1)组织块不宜太大，一般以厚度为2毫米，长度不超过0.5厘米*0.5厘米。(2)固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜，最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液能从上下左右前后各方都能渗入组织块。(3)固定的时间，一般以24小时为宜。2固定的注意事项2021/4/2622 (4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块，往往采用重新固定法处理。（5）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。2021/4/2

10、623常用的固定液有：（1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%40%甲醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%4%，也就是习惯上称为10%的福尔马林液。 （2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。3固定剂用以固定组织的药剂，称为固定液。2021/4/2624（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）（4）Bouins液：苦味酸饱和水溶液75份，甲醛25份，冰醋酸5份配制而成。 2021/4/2625（1）灌注法（Irrigation method）自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，注入固定液，30min后取材，置同一固定剂后固定。

11、 （2）浸入法（Immersion method） 。4固定方法2021/4/2626 材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。5固定后处理三种方式进行处理：（3）直接入脱水剂。（2）酒精充分洗涤；（1）流水冲洗；2021/4/26271、脱水的意义和目的 ：固定后组织其硬度不能达到切薄片的要求，须进行除固定以外的其他处理脱水就是继固定后的重要步骤脱水必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水剂。另外脱水必须进行得很彻底。 2、常用脱水剂：（1）酒精： （2）丙酮： （四）脱水与透明2021/4/26284、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。 二甲苯：透明组织的能力强，但

12、易使组织收缩和变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。 氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以延长至24小时也无妨。 3、透明的意义和作用： 透明剂能够同时溶解于脱水剂及包埋剂当中，它能逐渐渗入组织，最终将脱水剂完全排出。2021/4/26291 目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。2 种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包埋剂）等。（五）包埋2021/4/2630商品石蜡的处理：浸蜡 ：包埋：通常使用包埋盒。石蜡包埋法： 反复溶化、过滤以增加石蜡的

13、硬度和密度，并除去杂质。温度最好不超过该石蜡溶点的2以上；12h 。2021/4/2631 包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加满蜡，待包埋盒表面的熔蜡凝固后，将其移入加冰块的冷水中加速凝固，包埋即告完成。 2021/4/2632170%乙醇 常温 1224h 280%乙醇 常温 1224h 390%乙醇 常温 23h 495%乙醇 常温 12h 595%乙醇 常温 12h 6100%乙醇 常温 1h 7100%乙醇 常温 1h8二甲苯 常温 1520

14、min 9二甲苯 常温 1520min 10石蜡 4850 0.5h 11石蜡 4850 0.5h 12石蜡 5860 0.5h 13石蜡 5860 0.5h组织块处理时间表2021/4/2633 石蜡切片机可分三个部分，一是安装切片刀的部分，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。一是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。另一是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。（六）组织切片技术1、切片机简介：石蜡切片机1、切片机2021/4/2634德国冰冻切片机冰冻切片机制冷系统自动进样/切片系统 照明系统2021/4/26352、载玻片和盖玻片处理：新载玻片上有油污，

15、必须经过清洁液浸泡、充分漂洗、酒精浸泡、烤干备用。2021/4/2636 (1) 明胶液：这是粘片最常用的胶液，简便优良。 (2)蛋白甘油：鸡蛋清 50ml ，甘 油 50m1 ,水杨酸纳 1g 。 （3）树脂胶：又称白色乳胶，使用浓度为1%2%，以蒸馏水稀释即可。 （4） 多聚赖氨酸，APES（3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）。3、载玻片上涂粘附剂：2021/4/26374切片步骤： （1）切片刀或一次性切片刀必须锋利。（2）将切片刀安装在持刀座上（以15为宜）。（3）将蜡块（包埋盒）固定于支持器上，调整蜡块和刀刃至适当位置。（4）细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。

16、（5）修整蜡块（粗切）：匀速旋转切片轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。2021/4/2638（6）调节切片厚度调节器（一般为46m），进行切片，切出的蜡片应连续成蜡带。蜡带应完整无缺，厚度适宜、均匀，无刀痕、颤痕、皱折、开裂、缺损、松解等。（7）以专用小镊子轻轻夹到蜡片，放入伸展器的温水中（42左右），使切片全面展开。（8）将蜡片附贴于包被有粘附剂的载玻片上，蜡片应置放在载玻片右（或左）2/3处的中央，蜡片与载玻片之间无气泡。（9）放入温箱中，4045约1小时烘干即可。2021/4/2639见视频“使用切片机对石蜡包埋组织切片”2021/4/2640（七）染色:1、染料及染色液

17、简介： （1）苏木精 （2）洋红 （3）苏丹 （4）伊红 （5）碱性品（复）红 （6）结晶紫 （7）亚甲蓝或美蓝 （8）甲基绿 2021/4/2641苏 木 精 苏木精是最常用的碱性染料之一。它是一种无色或淡灰黄色粉末，从分子结构上，苏木精没有发色团，所以它本身不是染料，需要经过氧化和媒染后，才成为一种很好的细胞核染料。 氧化有两种方式： 1.自然氧化：需数周至数月。这种苏木精染液的保存和使用寿命较长。 2. 人工氧化：是指在配制苏木精染液时加入一定量的氧化剂如氧化汞、碘酸钠、高锰酸钾或过氧化氢等可立即使苏木精氧化成苏木红。 2021/4/2642 苏木红为弱酸性，呈红色，对组织的亲和力很小，

18、但当加入某些物质如二价或三价的金属盐如铝、铁盐后，染料分子就能与这些金属盐的离子结合形成色淀，这种色淀具有阳电荷，能与特定的组织成份牢固结合。这些二价或三价的金属盐就称为媒染剂。如硫酸铝钾、硫酸铝铵、硫酸铁铵。 染色机制还不很明确。从苏木红的结构式看，原有助色团羟基，又有了发色团醌型苯环，应属一种酸性染料，但由于酸性助色团羟基的酸性很弱，对组织的亲和力较小。加入媒染剂铝盐后，铝盐与苏木红螯合形成蓝紫色的铝-苏木红色淀，该色淀呈强盐基性，带正电荷，作用相当于碱性染料，即带正电荷的蓝紫色色淀和带负电荷的胞核脱氧核糖核酸磷酸基结合而完成染色。 2021/4/2643性状：红色粉末，易溶于水，溶液呈绿

19、色 荧光，能溶于醇。用途：组织学用于上皮细胞、肌纤维和细 胞质、细胞间质染色。伊 红2021/4/26442、Ehrlich苏木精的配制苏木精 2克、铵明矾 3克、无水酒精100毫升、甘油 100毫升、蒸馏水100毫升。此液配成后，须经12月，待它氧化成熟以后才能应用，故必须先配制。3、伊红液配制：伊红 2克、90%酒精 （或蒸馏水）200毫升。2021/4/2645（1）取组织块，经固定后，常规石蜡包埋，切片，厚46m。（2）切片常规二甲苯脱蜡，下行酒精至水。（3）明矾苏木精液染色510min，自来水洗去浮色。（4）1%盐酸乙醇分化20s（提插数下）。（5）自来水浸泡1 h。4、HE染色20

20、21/4/2646（6）上行酒精脱水：70乙醇5min80乙醇5min90乙醇5min。（7）置1%伊红液25min。（8）常规脱水，透明，封片。2021/4/2647胞核，嗜碱性，染为紫蓝色胞质，嗜酸性，染为红色2021/4/2648 5、关于HE染色时注意事项：（1）用含升汞的固定液固定的组织块,在切片染色前，应进行脱汞。具体方法：切片脱蜡，逐次进入70%酒精后，入稀碘液（碘1g，碘化钾2g，蒸馏水3000ml）510min。蒸馏水稍洗，入5%硫代硫酸钠溶液内5min。蒸馏水充分洗后进入染色。2021/4/2649（2）切片必须要充分干燥后才能进行染色；而染色过程中切忌让切片干燥。2021

21、/4/2650（3）用伊红水溶液染切片时，往往在经脱水的低浓度酒精时极易脱色，特别是对于细胞密集的组织更易出现这种情况。而用95%酒精配制的1%伊红染液则可获较满意效果。2021/4/2651（4）切片染苏木精后，分色这一步骤极为重要，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清晰，而细胞质等基本无色为佳。如果发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新染色后再行分色，总之必需分色至核很清楚而背景无色才能往下进行。2021/4/2652（5）当切片从酒精移入二甲苯透明时，产生白色云雾，致使切片呈现模糊不透明状态，是由于脱水不彻底或用于脱水的各级酒精不纯所致。应将切片退回无水酒精重新脱水，如再不透明时，则应更换无水酒精。（6）封固时，盖玻片一定要大于切片，如有漏出部分则不久将会褪色。2021/4/26539、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。23-7月-2223-7月-22Saturday, July 23, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。*7/23/2022 8:27:13 PM11、人总是珍惜为得到。23-7月-22*Jul-2223-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。*Saturday, July 23, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。23