钌配合物对DNA拓扑异构酶的抑制及其对三螺旋RNA稳定性的调控研究可编辑

1、钉配合物对DNA拓扑异构酶的抑制及其对三螺旋RNA稳定性的调控研究（可编辑）钉配合物对DNA拓扑异构酶的抑制及其对三螺旋 RNA稳定性的调控研究学校代号10530学 号201006061228分类号O613密级硕士学位论文钉配合物对DNA拓扑异构酶的抑制及其对三螺旋RNA稳定性的调控研究学位申请人曾乐立指导教师谭黎峰教授学院名称化学学院学科专业无机化学研究方向生物无机化学二？ 一三年五月DNA-Topo Inhibition and T-RNA Stability Regulationby Ruthenium!ComplexesCandidateLeli ZengSupervisor Pro.

2、 Lifeng TanCollege College of ChemistryProgram Inorganic ChemistrySpecializationinorganic BiochemistryDegree Science MasterUniversity Xiangtan UniversityDate May 2013湘潭大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别力口以标注引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 的成果作品。对本文研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全

3、意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年 月曰学位论文版权使用授权书本学位论文 作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的 规定，同意学校保留并向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和 电 子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湘潭大学可以 将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期：年 月曰导师签名：日期：年 月 日摘要本论文分为四章。第一章,简 单介 绍了 核酸DNA/RNAffi DNA拓扑异 构酶 的一 些基 本知 识，以及钉配合物与核酸、DNA拓扑异构酶相互作用的研究

4、方法及选题意义。第二章，本章设计合 成了四个 新型 的钉II配 合物，利用 元素 分析 及核磁共振等手段对配合物进行了表征。用光谱学和流体力学 等方法研究了配合物与DNA的相互作用,实验表明4个配合物均通过插入方式与DNA相互作用。 对比另2+ 2+外两个配合物,Ruphen tcpb 和Ruphen tcpb-2Br表现出与核酸更强的2 2键合能力。2+第三章,本章着重探究了钉配合物Ruphen tcpb 和22+Ruphen tcpb-2Br 对质粒DNA的光断裂及其机理，发现其二者均具有较好的2光断裂性能，这可能是由于OH?作为光断裂反应中的活性物质，从而引起了 DNA的断裂；同时着重探

5、讨了这两个配合物对DNA拓扑异构酶的 抑制研究，得出这两个配合物在低浓度条件下对Topo I和Topo II均有较好的抑制效果,而 且它们可能均是Topo双重毒剂，这对开发Topo毒剂及抗 癌药物有着重要的意义。第四章，本章研究了上述四个钉配合物与三螺旋RNA的相互作用。通过紫 外、荧光滴定及热力学等实验方法证明这四种钉配合物可能通过插入方式与三螺旋RNA相互作用，并对三螺旋RNA勺结构稳定产生一定的影响。同时也发现当配合物处于一定浓度时能提高三螺旋 RNA的Hoogsteen、Watson-Crick 氢键的解旋温度。迄今为止，关于钉配合物与三螺旋 RNA相互作用的研究报道还很少。因此此方面

6、的研究有待进一步发展与深入。关键 词：钉II配合物;DNA ;DNA拓扑异构酶；三螺旋RNAIAbstractThe thesis consists of four chaptersThe first chapter: Anintroduction was concentrated on the basic knowledge ofnucleic acids DNA/RNA and DNA topoisomeras, and the research methodsof DNAbinding and topoisomerase inhibition and the related curren

7、tsituationThe second chapter: four new and differenr ruthenium complexesweresynthesized and charactarized by HNMR and Elemental analysisThe properties ofDNA binding with RuII complexes have been studied by UV-Vis, emission spectraand viscosity measurements. The results reveal that these four complex

8、es bind to2+CT-DNA by classic intercalation mode, and the complexes of Ruphen tcpb and22+Ruphen tcpb-2Br interact with DNA more stronger compared to the two other2complexesThe third chapter: The DNA photocleavage activity and DNA photocleavage2+mechanism of two rutheniumII complexes Ruphen tcpb and2

9、2+Ruphen tcpb-2Br were emphatically explored , the results suggest that bothcomplexes have positive DNA photocleavage efficiency, and that their photocleavagemechanism may be that the OH? as an active agent in the cleavage reaction, whichenhances the photocleavage efficiency of DNA. The DNA Topoisom

10、erase inhibitionof these two RuII complexes has been researched by relaxation assay and strand2+passage assay. The results indicate that Ruphen tcpbp and22+Ruphen tcpb-2Br can inhibit the activities of Topo I and Topo IIeffecintly2Both of them are proved to be a dual Topo I/II inhibitor,which is mea

11、ningful the studyof anti-cancer drugThe fourth chapter, the interaction of the four rutheniumIIcomplexes andtriplex RNA has been studied. The experiment results suggest that, the fourcomplexes may bind with triplex RNA via intercalation mode by UV-Vis ,luminescence titration and thermal denaturation

12、 experiments, and they can affect thestability of the triple RNA s structure. We also find that whencomplexes under certainconcentration can improve the unwinding temperature of triple RNA sHoogsteen andWatson-Crick hydrogen bond. These studies are innovatory andmeaningful for thedevolopment of inor

13、ganic chemistryKey Words: RutheniumII complex; DNA; DNA-topoisomerase; TriplexRNAII目录第1章绪论？ ？?1.1前? ?核酸的结构与性质？ ？核酸的组成？ ？? 2核酸结构? ?3钉配合物对DNA断裂研究的理论基础? ? 5钉配合物抑制DNA拓扑异构酶研究的理论基础?5TopoI ? ?6TopoII? ?7DNA拓扑异构酶抑制剂? ? 8Topo I 抑制剂? ?8Topo II 抑制剂? ?三螺旋结构RNA ? 9选题意义及研究展望? ? 11第2章钉配合物与DNA相互作用的研究? ? 12引? ? 12实验

14、部分? ? 12仪器及试剂? ?12配体及配合物的合成? ? 13测试方法? ? 17实验结果与讨论? ? 18配合物的表征? ? 18配合物与DNA相互作用的电子吸收光谱 研究? 20配合物与DNA相互作用的稳态荧光光谱研?22配合物与CT-DNA相互作用的粘度研23?小结? ?23第3章钉II配合物作为Topos双重抑制剂的研24? ?3.1引? ? 243.2实验部分? ? 25实验试剂? ? 25实验测试方法? ? 25结果与讨论? ? 27III3.3.1光诱导配合物断裂质粒 DNA研究? ? 27Topo I 抑制研究? ? 29Topo II 抑制研究? ? 30配合物对DNA拓

15、扑异构酶I抑制机理研究? 31配合物对DNA拓扑异构酶II抑制机理研究? 32小结? ? 32第4章 钉配合物与三螺旋RNA的相互作用研究? ? 32前? ? 33实验? ? 33仪器和试剂? ?33测试方法? ? 34结果与讨论? ? 34三螺旋RNA的确定? ? 344.3.2配合物与T-RNA相互作用的可见吸收光谱研究? 354.3.3配合物与T-RNA相互作用的稳态荧光光谱研究? 364.3.4配合物与T-RNA相互作用的UV热力学变温研究? 37小结? ? 40论? ? ? 41献? ? ? 42谢? ?50? ?个人简51介? ? ?IV湘潭 大学 硕士论文 曾乐 立(2013 )

16、第1章绪论1.1前言1-3 4-6生物无机化学又称无机生物化学或生物配位化学，是生物化学、无机7-10化学、医学等多种学科的交叉领域，是20世纪60年代以来逐步形成的一 门新兴学科，同时也是目前科学家们研究得非常活跃的一个领域。生物无机化学主要研究如下方面的内容：金属配合物与核酸的相互作用及生物配体；生物无机 化学体系中的配位化学原理；生物化学反应中的金属酶和金属蛋白；固氮作用及 其在化 学上的模拟研究；光合作用及其在化学上的模拟研究；能催化水解反应 和其他化学反应的金属酶；碱土金属及其跨膜运送应用和生物体内的碱金属研究；环境生物无机化学的研究等若干研究领域。从1953年，科学家Watson和

17、Crick 提出DNA的双螺旋结构模型,到2001年科学家们绘制完成了人类基因组序列图，再到2012年诺贝尔化学奖得主罗伯特？莱夫科维茨和布莱恩？克比尔卡关于“G蛋白偶联受体研究”而备受关注，这些工作无疑为从根本上诠释生命活动的生物学，11-13并在基因诊断、 基因治疗以及基因工程药物的研发打下了坚实的基 础。目、乙刖生物无机化学的主要研究工作在于研制新型的金属配位化合物，再从中筛选出 具有选择性和活性的配合物做下一步的研究；也就是研究金属配合物在生物体内 对其组织机构、 生理代谢、 生理功能的影响及其 作用机制。研究的目的是为了探讨物质活性与生物结构之间的关系，从而为设计合成出高活性，低毒性

18、的新一类 金14-20属药物奠定基础。核酸是一种主要位于细胞内，充当生物体遗传信息携带者和传递者的生物大分子，是生物体的重要组成物质，对生物的生长、遗传和变异等生理活动起 着决定性作用它由脱氧核糖核酸(DNA )和核糖 核酸(RNA )组成。DNA携带物体的遗传信息，具有储存和传递遗传信息的功能。RNA不仅是遗传信息的携带者,而且也是生物体功能的执行者。DNA拓 扑异构酶(topoisomerases )是生21物体内一种呈拓扑形状的蛋白，它通过改变生物体DNA的拓扑结构，影响细22胞的复制和重组以及转录，因此是生物体内 一种十分关键的蛋白酶。本课题通过自组装合成三螺旋RNA ,应用光 谱学、

19、热力学方法，探讨钉配23-25合物对三螺旋RNA结构稳定及其构象转化的影响，并探讨钉配合物与核酸26-30之间的相互作用，配合物对DNA拓扑异构酶 活性的 抑制及其抑制机理。1湘潭 大学 硕士论文 曾乐 立(2013 )1.2核酸的结构与性 质核酸的组成核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成 上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸立体结构如下图所示。图1-1核酸核酸是含有磷酸基团的生物大分子，是一种多核甘酸，其基本结构单元是单核甘酸。自然界中的核酸可以分为 DNA和RNA两大类。核甘由碱基和戊糖组成，它们分别由喋吟、喀噬和核糖、脱氧核糖构成。

20、 核酸具体的组成以及碱基的分类如表1-1和1-2所示：表1-1核酸的组成DNA RNA核酸的组成分类胸腺喀呢T, thymine 尿喀呢U, uracil喀呢碱pyrimidine bases胞口密噬 C, cytosine 胞口密噬 C, cytosine鸟喋吟G, guanine 鸟喋吟G, guanine喋吟碱purine bases腺喋吟A, adenine 腺喋吟A, adenine酸acid 磷酸磷酸戊糖pentose B -D-2?-脱氧核糖B -D-核糖2湘潭大学硕士论文曾 乐立(2013 )图1-2核酸碱基核酸结构核酸结构可分为一、二、三及四级结构。一级结构是指构成核酸的各单

21、核 甘酸间连接键的性质及单核甘酸的数目多少和排列次序。核酸就是由许多核甘酸单位通过3 ,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核 酸具有方向性的长链状化合物，多核甘酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3- 端。一级结构式如下图1-3所示。图1-3 DNA的线条式缩写DNA的二级结构即DNA双螺旋结构，由科学 家Watson和Crick 在1953年提出，因在此方面的巨大贡献，他们在1964年获得了诺贝尔生理学奖。DNA二级结构有如下要点：第一,DNA是反向平行 互补的双链结构，它由脱氧核糖与磷酸基通过酯键相互交替连接形成并呈双螺旋状，所谓双螺旋只是就两条主链的形状而言；第二,D

22、NA双链的构型是右手螺旋 构型；第三,DNA双螺旋结 构具有高度的对称性，因为双链是通过喋吟与喀呢互补配对形成的双螺旋结构；并且碱基对能在旋转180?的情况下不影响双螺旋的对称性；第四,DNA双螺旋结构的稳定是靠疏水力和氢键以及 DNA分子碱基堆积力维系，具中碱基堆积力是使得双螺旋结构稳定的主要作用力；第五,DNA双螺旋表面能形成一大一小的两个凹槽，分别称作大沟和小沟，这些沟对蛋白质和DNA之间相互识别具有十分31-32重要的意义。DNA二级结构如图1-4所示。3湘潭大学硕士论文曾乐立(2013 )图1-4 DNA的双螺旋结构在双螺旋结构(二级结构)的基础上,DNA还可以形成三级结构。除了链状

23、结构之外，生物体普遍采取双链环形 DNA (double-stranded cyclic DNA )的结构。完整的双链环形DNA在某些情况下可以扭曲成麻花状的超螺旋(superhelix )或超卷曲(supercoil ) 结构。根据螺旋的方向 可分为 正超螺旋 和负超螺旋o 正超螺旋 使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加，而 负超螺旋 可以减少双螺旋 的圈数。几乎所有天然DNA中都存在负超 螺旋结构。图1-5两种不同形态的超螺旋结构4湘潭 大学 硕士 论文 曾乐 立(2013 )1.3 钉配合物对DNA断裂研 究的理 论基础钉配合物对质粒DNA的断裂及其方式与配合物的结构有着密切关系。目前认为

24、钉配合物对DNA的断裂主要有三种方式：光致能量转移、光致电子转 移断9裂(光致自由基氧化)和水解断裂。水解断裂是指参与反应的活性分子破坏了DNA的磷酸二酯键，但不对碱基和核糖环造 成损伤的一种断裂方式；光致电子转移断裂是指配合物通过接收 DNA传递过来的一个电子，使得配合物处于激 发态，当激发态的配合物的还原电位高于 DNA分子中鸟喋吟的氧化电位时二者发生氧化还原反应,DNA因此而断裂；光致能 量转移断裂是当前研究得比较多的一种断裂方式它是指在一定条件的光照下，化合物吸收一定波长的光后导 致自身能量增多，受到光电子激发而发生电子跃迁，处于激发态的化合物电子能够与DNA分子发生反应产生多种自由基

25、，如羟基自 由基（OH?,超氧自由基 （OOH? ）33-41或超氧阴离子（O）等,这些自由基能与DNA分子中的鸟喋吟碱基发生2氧化还原反应，从而达到断裂DNA分子的目 的。1.4钉配合物抑制DNA拓扑异构酶研究的理论基础DNA拓 扑异 构酶 是生 物体内一种 很重 要的 蛋白 酶，是 催化DNA拓扑 学异构体相互转变的一类酶的总称，在天然条件下主要是以超螺旋的形状存在。多数这类酶由一条或多条多肽链组成，其分子量可以到10万数量级，广泛存在于 各类生物体中，如一些病毒、真菌、植物和动物的正常和月中瘤细 胞的DNA分子中。近年关于DNA拓扑异构酶的研究得到了广泛的关注，随着研究的 深入，科学家们

26、发现这种酶在细胞的增殖和分化扮演着重要的角色 ，同时它也能维护细胞内基 因组的稳定性，以及在参与生物体DNA的复制、转录和重组等 过程中起到了十分42-55关键的作用。研究发现，这种酶通过催化 作用改变DNA分子的超螺旋构型，使得DNA双螺旋链能在超螺旋状态和与解旋状态之间顺利地 进行构象的转换。其具体的作用机制是酶引发两个连续的转酯化反应，反复的断开和修护DNA双螺旋主链的磷酸二酯键，从而直接或间接的对DNA复制、转 录等过程产生重要的影响。 根据DNA拓扑异构酶作用单链DNA或双链DNA这种差别,可以将Topos55-60主要分为拓扑异构酶I (Topo I )和拓扑异构酶II (Topo

27、 II ) 两大类。DNA拓扑异构酶如图1-6所示。5湘潭 大学 硕士 论文 曾乐 立(2013 )图1-6 Topos酶结构示意图Topo ITopo I是一种单亚基蛋白，含有756个氨基酸 残基，其相对分子质量大概为100KD ,位于第20号染色体编码区。Topo I作 用单链DNA ,通过 切断或连接一个61 2+DNA单链而改变DNA的拓扑结构，此作用过程不需要ATP以及金属Mg离子参与般来说,DNA负超螺旋程度越高,Topo I活性越高这是因为负超螺旋62-66状态的DNA含有高比例的单链DNA ,Topo I对单链DNA具有很高的识别 力。Topo I作用DNA如图1-7所示。图1

28、-7 Topo I作用DNA示意图6湘潭大学硕士 论文 曾乐立(2013 )1.4.2 Topo II某些DNA拓扑异构酶II也称彳乍为DNA促旋酶，真核生物的Topo II是二聚 体，由两个相同的亚基组成。从种类上区分,Topo II 可以分为两个亚型，a型和 B型；从组成成分上区分，Topo II 可以分成3个不同的 区域:N端区域、C端区域 和中部功能区域，每个区域有着不同的同源序列，这些序列具有不同的催化和识别等 功58能。Topo II能在DNA两条链上产 生缺口，但不是同时进行。NeilOsheroff 等科学家研究发现,DNA的一条链存在缺口时能促进第二条链的 断裂以及带有缺口型

29、的DNA分子可以看成是Topo II毒剂。这是由 于Topo II与DNA分子结 合后会影响了 DNA的结构并使之变形，同时使双链DNA的轨道也会弯曲，并且扭曲的程度比较大，而含有单链缺口的DNA有很强的构象柔韧性，所 以这种扭曲状态就67-70容易形成与维持。Topo II作用DNA过程如 图1-8所示。对比TopoI ,TopoII作用于DNA有如下一些区别：第一,Topo II 能诱导双连DNA断裂；而Topo I只能诱导单链DNA发生断裂。2+第二,Topo II 参与反应时，需要 依赖ATP、Mg等辅助因子；而Topo I则可以不依赖ATP而催化反应。第三，细胞水平的Topo II依

30、赖细月fi周期，它的 活性在不同的细胞生长期而不同；而Topo I则不依赖细胞生长周期，一直存 在 于细胞生长的过程中，且其活性不随细胞生长周期的不同而变化。图1-8 Topos作用DNA示意图7湘潭 大学 硕士 论文 曾乐 立(2013 )1.4.3 DNA 拓扑异构酶抑制剂近年来，科学家们发现多数抗癌药物都是通过作用DNAffi扑 异构酶来干扰调控DNA复制、重组以及基因表达而发挥医疗效果的，因此 以拓扑异构酶为作用靶点分子来设计各种具有较好活性和选择性的Topo抑制剂，并使这些抑制剂开71-75发成为抗月中瘤等药物，已经成为了月中瘤药物研究领域的新热点。化学小分子与Topos作用如图1-

31、9所示。图1-9化学小分子与Topos相互作用示意图1.4.4 Topo I 抑制剂目前，只有极少数的一些物质可以确定作为拓扑异构酶I抑制齐心已经被确定是Topo I抑制剂的有：原小集碱类生物碱极 其类似体、某些白屈菜生物碱、喜76-79树碱及其类似体和双-和四苯咪唾等。其中喜树碱及其类似体的生物碱是一类被研究得非常广泛且比较深入的 Topo I抑制齐心Topo I抑制剂可以分为 两类：Topo I催化抑制剂和Topo I毒剂。 两者都可以抑 制Topo I活性，使其不 能松弛DNA ,但是二者对DNA的作用机制不同。Topo I催化 抑制剂是通过抑制Topo I的 催化活性从而杀死细胞，因此

32、在一些Topo I低表达的 细胞中，这类抑制剂具有更好的性。Topo I毒剂则相反,它常与Topo I-DNA的共价复合物形成一种三元复合物，引起DNA断裂，使得DNA复制不能正常进行，因此导致细胞发生变 异或者导致细胞死亡。Muthukaman Nagarajan等科学家通过内酰胺链连 接两个了苗并异唯咻，发现这个连接后的化合物同时具有抑制 Topo活性的性质。甫并异唾咻是一种Topo I毒剂，具结构式如图1-10所示。8湘潭大学硕士论文曾乐立 (2013 )OON H NNH2NOO2CHF CO2图1-10甫并异唯咻1.4.5 Topo II 抑制剂与Topo I相似,Topo II抑制

33、剂也可以分为两种类型，一种是Topo II毒齐1J,另一种是Topo II催化抑制剂，它们的抑制机理 基本上和Topo I抑制剂相今为 止，无论是 处于 实验阶段还是临床阶段的，作为哺乳动物拓扑异构酶II 型80-82毒剂的药物研究得比较多，例如道诺梅素(daunomycin ) 、阿 霉素(adriamycin)、VP-16、放线霉素 D (actinomycinD )、替尼泊甘(teniposide ) 等。三种常见的Topo II 抑制剂如图1-11所示。OOHOOHSALOHO OOR3HN C NHHN N CH N NHCHS N ORHOOerbaroneICRF-193图1-1

34、1三种常见的Topo II抑制剂1.5三螺旋结构 RNA早在1957年，Rich 等科学家最先提出了三螺旋核酸 polyU? polyA*PolyU的合成方法。从那之后，一些科学家陆续在实验室里制备出了三螺旋DNA 和三螺旋RNA，并探究了它们的结构与性质以及三螺旋的合成机理。研究表明，三螺旋结构可以通过一条相对短的 DNA链或RNA链与任何一条双链的DNA或9湘潭大学硕士论文曾乐立(2013 )RNA而作为序列特异性识别和键合的 工具。三螺旋结构作为许多细胞处理生理活动的潜在工具被给予了极大的关注。最近,Bailey 教授等详细地叙述了三螺旋核酸在生物体内的潜在功能，这为理解基因组生物学和基

35、因调控研究开拓了新的83,84理论依据。 然而，根据Hoogsteen碱基配对原 则，对比双 链结构，三螺 旋核酸的稳定性要差一些。与双链的变性温度相比，其第三链从三螺旋结构中解旋下来的温度要低很多。正是由于它的不稳定性，限制了它在体内，例如结构探针、85-87蛋白质合成抑制剂以及治疗药物等方面的应用。因此，如何提高三螺旋核酸的稳定性是一个迫切需要解决的难题。然而分子识别、 键合以及稳定三螺旋核酸结构的特异性序列也是需要深入探讨的知识点。在过去的二十年里，对生理条件下三螺旋DNA性质的研究给予了相当多的关 注，同时也报道了许多能够提高 三螺旋稳定性的小分子。但是，对三螺旋RNA稳定性以及结构方

36、面相关热力 学 因素的研究却很少。止匕外，现在这些研究都主要 针对的是有机化合物，只有很 少的是针对金属配合物。相比有机化合物，金属配 合物由于其配位金属中心，它的结构更加多样，在某些情况下，有更好的环境稳定性和更多样的可调电子特性。近年来已有不少对具有平面芳香配体的过渡金属配合物与双链DNA的研 究，八面体钉多叱噬配合物由于它贯穿三维空间的手性结构、光物理性质和独特的化学性88-90质，引起了人们广泛的关注。图1-12三螺旋RNA10湘潭 大学 硕士论文 曾乐 立(2013 )1.6选题意义及研究 展望目前，癌症在世界范围内的发病率越来越高，如果不积极干预，2030年全球预计将有1320万人死于癌症，且1/4在中国。进一步的数据显示，癌症早期发现治愈率可达65%，而化疗是目前临床治疗癌症 主要手段之一，因此开发出新型、高效且对正常细胞无毒性的抗月中瘤药物显得尤为迫切。长期以来，抗月中瘤药物主要是有机化合物，直到顺柏被科学家发现具有抗月中瘤活性效果，金属药物才引起了人们的热切关注。在众多金属配合物中，金属钉及其配合物由于其具有低毒、46,48,51易吸收、在体内易排泄的特点被看成 是最有前途抗癌药物之一。目前，金属钉配合物作为治疗、诊断及