原位杂交实验操作步骤(共7页)

1、原位杂交实验(shyn)操作步骤一 HYPERLINK /zt/dna/201562.html t _blank 质粒制备(zhbi)1质粒的转化(zhunhu)和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200/tube)，-80保存。2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/1的质粒DNA41加入到8O1感受态菌

2、中。3.轻轻摇匀，冰浴30min。4.42热激9O秒，然后迅速冰浴2min。5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37，100转/min水浴孵育60min。6.取200l菌液铺于 HYPERLINK /zt/focus/agar.html t _blank 琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1l/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37培养12-16h。1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37，200转/分培养2h，取1ml之一Ep

3、pendorf离心管，加50l10mmol/L HYPERLINK /zt/focus/edta.html t _blank EDTA(pH8.0)。2.加入50l新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。3.在70温育5min，然后冷却到室温。4.加1.514mol/LKCl和0.51含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。5.12000g，4离以3min，以除去细菌碎片。6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5g/ml)，取50l上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2

4、/3-3/4时，停止(tngzh)电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。1.3质粒的扩增和纯化(chn hu)1.用无菌牙签(yqin)分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50g/ml)培养液的聚丙烯管中，于37，200转/分培养3h。2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170/ml)。37，200转/分培养12-16h。4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm

5、，4离,th,15min，沉淀细菌。5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。8.6000rpm，4离心15min，保留上清。9.将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。(或-204h，或4过夜，可便核酸沉淀)10.12000rpm，4离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。11.于室

6、温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。12.用500lTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600l，充分混匀。12000rpm，4离心15min，以沉淀高分子量的RNA。14.将上清转移(zhuny)到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分(chngfn)混匀，于室温静置10min。15.12000rpm,4离心15min，回收核酸。小心(xio xn)弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。

7、16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。17.400l含无DNA酶的RNA酶(20g/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。18.加入400l13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，412000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。19.加入400lTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：2

8、4：1)、和氯仿各抽提一次。20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约5013M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4放置30min。21.于412000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。22.加入400l处于4的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，412000rpm离心2min。23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。24.用100lTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。25.取4l溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯

9、度和浓度(OD260/OD2801.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(g/l)。26.质粒DNA溶液于-20保存待用。二、cRNA HYPERLINK /zt/dna/tanzhen.html t _blank 探针的标记1.将质粒DNA，用相应的 HYPERLINK /zt/protein/225128.html t _blank 限制性内切酶线性化，通过琼脂糖 HYPERLINK /zt/experiment/page.html t _blank 凝胶电泳以确保完全线

10、性化。2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤(bzhu)19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成(hchng)地高辛标记的反义和正义RNA探针。3.进行体外转录(zhun l)，步骤如下：4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。三、 HYPERLINK /zt/experiment/222145.html t _blank 原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1. 将子宫样品从-80 取出，用OCT包埋，在-23 (切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10m厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(

11、1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 干烤6小时)，保存于-70 冰柜备用。2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛- HYPERLINK /zt/product/pbs.html t _blank PBS(pH 7.4)固定lOmin。3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1g/m1)，37 孵育15 min，重复步骤4)。6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA(乙

12、酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7. 5 x SSC中平衡15 min。3.2杂交8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 l/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，5558 下的烘箱中预杂交2 h。9. 甩掉预杂交液，地高辛标记(bioj)的反义或正义cRNA探针(tn zhn)(浓度1-2ng/l)经70 变性(binxng)1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60l/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在4858

13、 下杂交18-30 h。3.3杂交后处理1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 预热的5SSC洗30 min。11.在无DNA的RNA酶A(20g/ml)溶液中37 下孵育30 min。12.分别依次用52 预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。3.4杂交信号检测13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：5001:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。16.在

14、缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.51 NBT和3.51 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。21.脱水、透明，用中性树胶封片。22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。 HYPERLINK /zt/dna/tan

15、zhen.html t _blank 探针(tn zhn)标记(bioj)方法有DNA的缺口平移法。缺口平移是一种快速、简便、成本(chngbn)相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。该技术可以制备序列特异的探针。当使用重组 HYPERLINK /zt/dna/201562.html t _blank 质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和 HYPERLINK /zt/experiment/page.html t _blank 凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。DNA的随机

16、引物法。这种方法是使用寡核苷酸引物和 HYPERLINK /zt/disease/219828.html t _blank 大肠杆菌 HYPERLINK /zt/dna/2339.html t _blank DNA聚合酶的Klenow片段来标记DNA片段。这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50以上。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。标记的探针可以直接使用而不

17、需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。随机引物可用于较小的DNA片段（100500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（1000 bp）效果最好。随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶产生缺口。RNA的体外转录法。体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。RNA的寡脱氧核苷酸法。克隆质粒pSP64、p

18、GEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。寡核苷酸的“接尾法”。末端脱氧核苷酸转移酶可将三磷酸脱氧核苷加到DNA分子游离的3-OH末端。这种脱氧核苷酸连接将在探针3末端形成一个延伸的“尾巴”。用这种方法可加上许多基因以产生高比活性的探针，适用于基因库中克隆序列的鉴定，基因组DNA样品的点突变检测和 HYPERLINK /zt/experiment/222145.html t _blank 原位杂交。5端寡核苷酸的T4多聚核苷酸激酶法。T4多聚核苷酸激酶可将-32P-ATP的-磷转移到游离的5-OH端上。合成寡脱氧核糖核苷酸时，它们通常未被磷酸化，因而在5端应含有一个羟基。由于探针分子只掺入了一个同位素分子，故探针活性与其长度有关。短寡核苷酸可被高比活性标记，而较长的探针活性则随其长度增加而降低。这种激酶标记方法最常用于DNA序列测定。聚合酶链反应标记法。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于标记比活性DNA片段，这种技术具有很高的特异性，可以(ky)在12