第八讲蛋白质分选与膜泡运输(1)ppt课件

1、 第八讲蛋白质分选与膜泡运输. 核糖体合成的蛋白质，合成之后必需准确无误地运送到细胞的各个部位，在进化过程中每种蛋白构成了一个明确的地址签address target),细胞经过对蛋白质地址签的识别进展运送，这就是蛋白质的分选.第一节 细胞内蛋白质的分选一、信号假说与蛋白质分选信号二、蛋白质分选转运的根本途径与类型三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选.一、信号假说与蛋白质分选信号信号序列的发现和证明 微粒体实验 为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的蛋白质插入内质网?对此,美国洛克菲勒大学的 Gnter Blobel、Davi

2、d Sabatini 和Bernhard Dobberstein 等于1971年提出两点建议 分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列(signal sequence),可将多肽和核糖体引导到ER膜上;多肽经过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推测多肽是在合成的同时转移的。.1960年获得蒂宾根大学医学学位； 1967年在威斯康星麦迪逊大学获得肿瘤学博士学位； 1967-1968进入了纽约市洛克菲勒大学细胞生物学实验室继续从事生物研讨; 1969-1973 在洛克菲勒大学任助教； 1973-76 在洛克菲勒大学任副教授； 1976-今 在洛克菲勒大学任教授； 1986-今 兼任洛克菲勒大学霍华

3、德-休斯医疗中心研讨员。 1971年，布洛贝尔对上面的问题提出了“信号假说，能否细胞分泌出的蛋白质内有引导细胞穿膜的信号。这只是他提出的一种推断。 1975年，布洛贝尔系统地阐明了这种信号是由特殊陈列的氨基酸组成，蛋白质在分解和合成的过程中，会经过一个通路而穿过细胞器。不仅如此他还详细地研讨实际，证明信号假说还顺应植物、动物等细胞的普遍规律。 1980年，布洛贝尔在研讨中提出每个蛋白质内部都有指明其在细胞中正确位置的信息功能，氨基酸的顺序决议了一个蛋白质能否会穿过膜进入到另一个细胞器，或者移到细胞外。(GunterBlobel).在George Palade用离心技术分别到有核糖体结合的微粒体

4、,即发现膜结合核糖体(membrane-bounded ribosome)之后, 科学家推测:膜结合核糖体合成的蛋白质首先要进入内质网的腔,然后经过选择性的分泌过程输出到细胞外,而游离核糖体上合成的蛋白质那么留在细胞内运用。 为了研讨内质网上合成的蛋白质能否进入了内质网的腔, Colvin Redman 和 David Sabatini用分别的RER小泡(微粒体)进展无细胞系统的蛋白质合成, 证明了膜结合核糖体上合成的蛋白质进入了微粒体的腔。 .乔治埃米尔帕拉德(Palade，George Emil，1912-)，罗马尼亚细胞生物学家。 在细胞生物学方面的开辟性任务，他与比利时的克里斯汀勒内德

5、迪夫Christian Ren de Duve和美国的艾伯特克劳德Albert Claude共同获得了1974年的诺贝尔生理学-医学奖。帕拉德的奉献包括对电子显微镜方法的开展，发现了核糖体ribosome，以及对高尔基体Golgi apparatus的研讨等。. 信号序列存在的直接证据 1972年,Csar Milstein和他的同事用无细胞系统研讨免疫球蛋白(IgG)轻链合成时获得了信号序列存在的直接证据, 证明Blobel等的建议是正确的。他们用分别纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指点合成多肽,发现合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链,

6、它有20个氨基酸,他们推测,这段肽具有信号作用,使IgG得以经过粗面内质网并继而分泌到细胞外。 .加与不加RER小泡,产物不同 当将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中进展翻译时, 假设不加粗面内质网(微粒体), 获得的翻译产物比从细胞中分泌出来的蛋白要长,假设添加RER小泡,翻译的产物长度与从活细胞分泌的蛋白一样。因此推测信号序列在引导蛋白进入内质网后被切除了,所以成熟的蛋白的N-端没有信号序列(图9-16)。 (a) 在不含RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,其N-端有信号序列,故比从细胞中分泌出来的一样蛋白质肽链长;(b)在加有RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,信号序列在RER小泡中被

7、切除,得到的产物与从细胞中合成分泌的一样。 . 信号序列的普通特征及早期信号假说G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在研讨中还发现信号序列具有一些共同的特性:长度普通为1535个氨基酸残基, N-末端含有1个或多个带正电荷的氨基酸,其后是612个延续的疏水残基;在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网,进入内质网后通常被切除(图9-17)。 图9-17 ER跨膜可切除信号的普通构造 .一些信号肽序列信号功能 举 例 蛋白进入ER +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Ler-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Al

8、a-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln- 滞留在ER中 -Lys-Asp-Glu-Leu-COO- 蛋白进入线粒体 +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu- 进入细胞核 -Pro-Pro-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- 进入过氧化 物酶体 -Ser-Lys-Leu- . 早期的信号假说 1975年, G.Blobel和 B.Dobberstein 根

9、据对信号序列的研讨成果,正式提出了信号假说(signal hypothesis),要点是:(1)分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核糖体;(2)合成的N-端信号序列显露核糖体后,靠自在碰撞与内质网膜接触,然后靠N-端信号序列的疏水性插入内质网的膜; (3)蛋白质继续合成,并以袢环方式穿过内质网的膜; (4)假设合成的是分泌的蛋白,除了信号序列被信号肽酶切除外,全部进入内质网的腔,假设是膜蛋白,那么由一个或多个停顿转移信号将蛋白质锚定在内质网膜上。 . 信号假说证明: 基因重组实验 信号假说提出后得到许多实验的支持,其中最有力的一项实验结果是杂合蛋白研讨的结果。黑猩猩的-球蛋白是一种在游离核糖体上

10、合成并存在于胞质溶胶中的可溶性蛋白,科学家在编码该蛋白的基因上接上一段编码E.coli分泌蛋白-半乳糖透性酶(-lactamase)的信号序列DNA, 然后将该基因参与到无细胞的转录和翻译体系中,并参与从狗组织中分别的ER膜,研讨结果发现,杂合蛋白出如今ER腔中,而且信号序列被切除了。这一研讨结果不仅证明了信号假说的正确性,也提示了信号序列的一个重要特性:信号序列没有特异性,并且原核生物的信号序列在真核生物中也是有效的。. 新蛋白复合物的发现与信号假说的补充 信号识别颗粒(signal recognition partical, SRP 1981年,发现了信号识别颗粒(signal recog

11、nition partical, SRP),是一种核糖核酸蛋白复合体,沉降系数为11S，含有分子量为72kd、68kDa、54kDa、19kDa、14kDa及9kDa的6条多肽和一个7S(长约300个核苷酸)的rRNA(图9-18), SRP上有三个功能部位: 翻译暂停构造域(P9/P14)、信号肽识别结合位点(P54)、SRP受体蛋白结合位点(P68/P72)。它的作用是识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上. . 停靠蛋白 (docking protein, DP) 即SRP在内质网膜上的受体蛋白,它可以与结合有信号序列的SRP牢牢地结合,使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。 . 由

12、TRAM蛋白和Sec61蛋白构成，可结合信号肽和停顿转移序列，引导新生肽进入ER腔，在构成跨膜蛋白中有重要作用。易位子(translocon)：. 释放到内质网腔蛋白的合成分泌蛋白和驻留蛋白信号肽在游离核糖体上合成信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与DP结合核糖体和ER膜上的核糖体受体结合 SRP脱离信号肽，被释放肽链继续合成，信号肽开启ER膜上的易位子，引导新生肽链进入ER腔信号肽被切除肽链延伸至终止。分泌蛋白和跨膜蛋白的转运方式：.+微粒体SRP DP产生含信号肽的完好多肽合成70100aa后，肽链停顿延伸信号肽切除，肽链进入微粒体ER腔中含切除信号肽的酶保管信号肽的蛋白游离核糖体+含编

13、码信号序列的mRNASRP阻止蛋白合成DP可重新启动由SRP阻止的蛋白合成. 跨膜蛋白构成跨膜蛋白：多肽链疏水性节段构成的螺旋跨膜。内信号肽：位于多肽链内部的疏水性信号序列，内信号肽具有起始转移和终止转移信号功能。停顿信号可以使易位子钝化，使多肽链转移停顿，跨膜。停顿转移序列： 仅存在于跨膜蛋白上的一段aa序列，与内质网膜的亲合力很高，和易位子结合后阻止肽链继续进入网腔，是跨膜Pr的跨膜段。停顿转移序列.coo-coo-coo-coo-coo-NH3+NH3+NH3+NH3+NH3+内质网膜整合蛋白的拓扑学类型跨膜蛋白的方向性.1单次跨膜蛋白整合到ER膜的方式： 单次跨膜蛋白有一个末端起始转移

14、序列，一个停顿转移序列，依托停顿转移序列跨膜。或只需一个中间转移信号序列,依托其转移和跨膜。.2双次跨膜蛋白整合到ER膜的方式： 一个中间开场转移序列，一个停顿转移信号，依托二者共同跨膜。.3多次跨膜蛋白整合到ER膜的方式： 具有两个以上中间转移序列和停顿转移序列，多肽链前后来回反复的经过脂双层。.二、蛋白质分选转运的根本途径与类型核基因编码的蛋白质的分选途径：后翻译转运途径(2) 共翻译转运途径. 根据蛋白质分选的转运方式或机制不同，又可将蛋白质转运分为4类：.三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选 转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质分选是一个多步过程，需求多个不同的

15、靶向序列，定位到叶绿体的前体蛋白N端具有40-50个氨基酸组成的转运肽，用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿过叶绿体被摸进入到基质或类囊体中。转运到线粒体和过氧化物酶体的蛋白质与此类似，即靠的是N端的导肽或C端的靶向序列。.蛋白质合成定位的特点：后转移方式 转运前的形状： 伸展的前体蛋白 N端的蛋白质信号序列称导肽 前体蛋白=成熟蛋白+导肽 导肽的特点：1多位于N端，约由20个氨基酸，富含精氨酸、带羟基的 氨基酸。2构成一个两性的螺旋，带正电荷的亲水氨基 酸和不带 电荷的疏水氨基酸分别位于的两侧。3对转运的蛋白质无特异性的要求。.1 线粒体前体蛋白定位分选信号线粒体前体蛋白定位分选信号大致可以分

16、为两类：可剪切的前导序列和非剪切的多种整合定位信号.信号序列定位转运安装信号序列位置位于N端，富含带正电荷的和疏水的氨基酸，构成两性螺旋，完成转运后被切除。基质TOMTIM23 不被切除，含疏水性的停顿转移序列，被安插到外膜。外膜TOM 被切除，含疏水性的停顿转移序列，被安插到内膜。内膜TOMTIM23 含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入内膜或膜间隙。内膜膜间隙TOMTIM23 构造类似于N端信号序列，但位于蛋白质内部。内膜TOMTIM23 为线粒体代谢物的转运蛋白，如腺苷转位酶，具有多个内部信号序列和停顿转移序列，构成多次跨膜蛋白。内膜TOMTI

17、M22 .线粒体基质蛋白的定位分选信号为可剪切的前导序列.参与该运输途径的蛋白质分子机器主要有：TOM、TIM23 和PAM 复合体。担任转运内部具有信号序列的蛋白担任转运N端具有信号序列的蛋白担任TOM 复合物的组装前体蛋白首先与外膜外表受体Tom20 结合，然后转移至Tom22。在Tom5 的协助下，前体蛋白以去折叠形状并以N 端先经过的方式穿过TOM 复合物的跨膜通道。在TIM23 复合物亚基Tim23 和Tim50 的协同作用下25，出如今膜间隙侧的前体蛋白被牵引至TIM23 复合物外表。在线粒体内膜膜电位和mtHsp70 水解ATP 提供的能量驱动下，前体蛋白穿过TIM23 跨膜通道

18、，并依次与Tim44 和mtHsp70 结合，最终被mtHsp70 牵引进线粒体基质。在基质中，前体蛋白被MPP 水解剪切掉前导肽后折叠构成成熟的蛋白2 线粒体前体蛋白质向基质的转运.3 线粒体前体蛋白质向内膜的转运代谢物转运体蛋白的运输需求TOM 复合物、TIM22 复合物和小Tim 复合物等众多分子机器的参与.除此之外，线粒体DNA 也编码一些蛋白质，而且这些蛋白质都定位于线粒体内膜上，它们的转运也是由OXA 复合物介导的.4 线粒体前体蛋白向膜间隙的转运线粒体膜间隙蛋白的转运主要有三种途径：二元导肽运输途径、折叠诱捕运输途径和亲和结合运输途径.5线粒体前体蛋白向线粒体外膜的转运线粒体外膜

19、主要有两类蛋白质： 桶状蛋白质-barrel protein 和 螺旋蛋白质-helical proteins。 桶状蛋白质向线粒体外膜分选的详细过程.6 叶绿体蛋白质的转运叶绿体与线粒体蛋白转运的一样点1、蛋白质合成定位的特点：后转移方式2、通常前体蛋白N端具有蛋白质信号序列转运肽，完成转运后被信号肽酶切除3、每一种膜上有特定的转位因子 外膜的转位因子被称为TOC复合体 内膜的转位因子被称为TIC复合体。4 、内外膜具有接触点contact site；5、需求能量，同样利用ATP和质子动力势。 .不同点： 转运到叶绿体类囊体腔 前体蛋白含有两个N端信号序列，第一个被切除后，暴显露第二个信号序

20、列，将蛋白导向内膜或类囊体膜。 转运到叶绿体类囊体膜 前体蛋白，N端的导肽引导蛋白经过叶绿体膜进入基质， 肽酶水解导肽。引导蛋白质到达类囊体膜的信息，蕴藏在成熟蛋白C端的跨膜区域。 图.7 过氧化物酶体蛋白的分选Pex2Pex10Pex12Pex14Pex5COO- PTS1过氧化物酶体 靶向序列NH3+细胞质过氧化物酶体膜1234.Pex3Pex16Pex19Pex19Pex5Pex7过氧化物酶体 膜蛋白PMP70Pex16Pex3 PTS1分选信号基质蛋白 PTS2分选信号基质蛋白Pex14Pex12Pex10Pex2Pex11Division内质网小泡过氧化物酶体 雏形. 第二节 膜泡运

21、输 普遍存在于真核细胞中，是蛋白运输的一种特有方式。在转运过程中涉及蛋白本身的修饰、加工和组装，及不同膜泡定向运输和复杂的调控过程。 10种运输小泡参与完成胞内的膜泡运输，其上有特殊标志，可以保证转运物质到达特定部位。.网格蛋白有被小泡；COPII有被小泡；COPI有被小泡；1.参与膜泡运输的三种不同类型的有被小泡.1网格蛋白包被小泡 构造：网格蛋白组成外层构造骨架；接合素构成内壳。功能： a.担任蛋白质从高尔基体TGN到质膜、胞内体或溶酶体和植物液泡的运输。 b.在受体介导的细胞内吞途径中担任将物质从质膜运到细胞质，以及从胞内体到溶酶体的运输。网格蛋白接合素蛋白受体货物分子. 网格笼形蛋白:

22、 由3个重链和3个轻链构成的具有3个曲臂外形triskelion的蛋白。笼形蛋白的曲臂部分可相互交错，构成5/6边形网孔的“笼子。 网格蛋白的构造，A电镜照片，B分子模型，C衣被模型。 重叠臂曲臂末端接合素重链轻链.接合素/衔接蛋白adaptors 介导网格蛋白与膜受体之间的衔接。 类型： AP1：高尔基体内体的蛋白运输； AP2：质膜内体的蛋白运输； AP3：高尔基体溶酶体的蛋白运输。.当笼形蛋白衣被小泡构成时，发动蛋白聚集成一圈围绕在芽的颈部，将柄部的膜尽能够地拉近小于1.5nm，导致膜交融，掐断衣被小泡。其还可召集其它可溶性蛋白在小泡的颈部聚集，经过改动膜的外形和膜脂的组成，促使小泡颈部

23、膜交融，构成衣被小泡。 网格蛋白有被小泡介导的选择性运输.功能：介导从内质网到高尔基体的物质运输。构造组分：Sar1：GTP酶，结合GDP失活，结合GTP活化；调理包被的装配和去装配；召集其他包被蛋白构成包被；Sec23/Sec24复合体：和Sar一同构成包被内层；Sec13/Sec31复合体：构成包被外层；Sec16：能够作为骨架蛋白起作用；Sec12：Sar1的鸟苷酸交换因子。 2) COPII 包被小泡G蛋白具有两类重要的调理蛋白，即：鸟苷酸交换因子guanine-nucleotide exchange factor, GEF和GTP酶激活蛋白GTPase activating prot

24、ein, GAP。GEF的作用是使G蛋白释放GDP，结合GTP而激活。GAP的作用是激活G蛋白的酶活性，使GTP水解，G蛋白失活，G蛋白本身的GTP酶活性不高。除单体G蛋白以外，三聚体G蛋白也起分子开关的作用，控制衣被小泡的构成。 .被运输蛋白跨膜受体装配： Sar1-GDP Sar1-GTP(活化) Sec12显露一条脂肪酸的尾巴，插入内质网膜，促进其他衣被蛋白的活化和组装。激活磷脂酶D，将一些磷脂水解，使构成衣被的蛋白结实地结合在膜上。构成运输小泡当衣被小泡从膜上释放后，GTP水解，衣被解体。.3) COPI包被小泡 组成： COPI包被含有8种蛋白亚基， 其依赖ARFGTP酶调理包被的装

25、配与去装配； 功能： 担任回收、转运内质网逃逸蛋白escaped proteins前往内质网Golgi ER，逆行转运; 行使从ERER-Golgi中间组分Golgi的物质运输。 在组成性分泌过程中，其在非选择性的批量运输中行使功能。由7个亚基组成:、. COP被膜小泡的构成经过无细胞系统研讨了COP运输小泡的出芽过程(图9-69)： 一种胞质溶胶中的小分子GTP结合蛋白,即ARF,释放所结合的GDP,然后同GTP结合,构成ARF-GTP复合物,并整合在高尔基体膜中。GDP与GTP的交换是由高尔基体膜中的一种酶催化的； COP同ARF以及高尔基体膜蛋白的细胞质部分结合；在脂酰CoA(fatty-acyl CoA)的协助下构成COP被膜小泡,但脂酰CoA确实切作用尚不清楚。一旦COP小泡构成就立刻从供体膜释放出来，COP包被去聚合, 并与膜脱离, 这一过程是由与ARF结合的GTP水解所触发 .内质网中保管及回收蛋白质的两种机制：运输泡将应被保管的驻留蛋白排斥在外，防止出芽转运； 经过识别驻留蛋白C-端的回收信号的特异性受体，以COPI-包被小泡的方式捕获逃逸蛋白。内质网蛋白的回收信号：网腔的蛋白：Lys-Asp-Glu-LeuKDEL；膜蛋白如SRP受体：Lys-Lys-X-XKKXX，X：恣意氨基酸。 由于内质网的驻留蛋白