医学分析仪器原理实验1(共7页)

1、分光(fn un)光度计性能检测与滤光片的滤光特性曲线(qxin)的测定一、实验(shyn)目的和要求1、掌握分光光度计的性能检测及校准方法：包括波长检测、杂光检测以及 比色皿配对。2、掌握分光光度计的使用方法。3、测定吸收滤光片的滤光曲线并熟悉其滤光特性预习要求： 实验前请阅读本实验指导书，分光光度计和滤光片的工作原理、性能指标以及使用方法可参阅理论课教材和附录 1：752N 紫外/可见光 分光光度计的使用 指南二、实验原理根据朗伯一比尔定律 A=kbc（式中，A 为吸光度，b 为液层厚度，c 为溶液浓 度），我们可知当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与溶液的浓度及液层 厚度成正比，在溶

2、液吸收曲线的峰值处这种关系最明显，这就是分光光度法所使 用的基本原理。紫外/可见光分光光度计就是利用物质对光的有选择吸收现象并 采用分光光度法来测量物质的浓度的仪器。紫外/可见光分光光度计种类繁多，但其基本结构都由光源、单色器、样品 池、检测器和放大显示系统 5 部分组成。如图 1-1 所示。图 1-1 752 型可见分光光度计结构示意图卤钨灯所发出的各种波长的混合光通过单色器将所需的单色光分离出来， 然后照射到试样室内的比色皿中；透过比色皿的剩余光能被光电管所接收并转 换成与光能成比例的电信号；这个电信号经过放大后再经过对数转换后形成了与溶液浓度相关的吸光度(gungd)信号。这个吸光度信号

3、可直接或与另一比色皿所测得的吸光度信号组合，通过计算(j sun)就可得到待测溶液的浓度。 通过对朗伯比尔定律分析可知，分光光度计的测量精度主要(zhyo)取决于以下的因素：单色光波长的准确性，所测定的透射率和吸光度测量值的准确性，以及杂散 光的影响。仪器在出厂后至用户初次使用前以及仪器经过一段时间使用后都需对 这些影响仪器的测量精度的这些因素进行检查和校准。此外，在使用时也有一些 影响测量精度的其他因素，因此需要通过一些测量和校正手段来消除这些不利因 素：如测量比色皿与参比比色皿的配对性测量等。在实际对分光光度计进行波长、杂散光校正时，通常使用滤光片进行校正。 滤光片是一种通过对透过光选择性

4、地过滤来选择出所希望透过波长的单色光的 一种玻璃器件，它也是早期的光电比色法中选取单色光的主要手段。滤光片除了 具有过滤单色光外，它还具有光波的某一波段的阻断、衰减（全波段或某一窄波 段）等功能，因此在光学仪器中获得了广泛应用。滤光片根据其工作原理分为吸 收滤光片，干涉滤光片，反射滤光片等。根据滤光的光谱特性，滤光片又可分为： 带通滤光片、 HYPERLINK /view/1949857.htm 截止滤光片、中性滤光片等。本实验中使用了镨钕滤光片来对分光 光度计的波长进行校准。镨钕滤光片是一种含有稀有金属镨(pr)和钕(Nd)的玻璃 制品。它具有固定的光谱吸收特性,性能稳定，在波长 40090

5、0nm 范围内有 14 个强弱不同的吸收峰,其中在 529nm，741nm 和 807.7nm 处的吸收峰峰形尖锐,峰 位准确.因而它们可用于校正分光光度计的可见光段的波长;而紫外波段可使用 钛玻璃片，它在 279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm 处有比较尖锐的吸收 峰。杂散光的存在也是影响分光度计的测量精度的一个重要因素.对杂散光进行 精确地评估可以提高仪器的精密度和准确性。 三、实验仪器、器材和试剂1、紫外-可见光谱仪（752N），上海精密科学仪器公司生产，技术指标如下：1）、测量波长范围：200-1000 nm2）、光度范围：0.000A-1.999 A3）、透射

6、比测量范围：0.0%-100.0%4）、波长最大允许误差：土 2nm5）、波长重复性：1nm6）、浓度直读范围：0000-99997）、光度系统：单光束，1200 线/mm 全息光栅2、镨钕滤光片和钛滤光片各 1 片3、白纸条(zh tio)、黑纸片、蒸馏水等；4、标准(biozhn)玻璃比色皿（1X1 cm）2 只。四、实验(shyn)内容和操作步骤1. 分光光度计中光源和单色器的校准(1)开机预热 15 分钟后，对仪器作暗电流调整（样品室盖处于开启状态）。(2)可见光区域的黄光波段比较狭窄，适用于光度计波长的粗测。打开样品室盖 旋动波长调节旋钮，观察波长调节窗将波长调节到至 580nm，在

7、比色槽中光 路经过处放一白纸条，观察是否有均匀的黄光。如不为黄色则表明单色器发生严重偏差，需对单色器进行修理。在观察光斑的颜色的同时，观察光斑的 形状。调整良好的光斑应清晰完整，无杂乱光。如光斑发散或有多个光斑出 现则说明单色器的光路的聚焦不良或有杂散光的出现。(3) 取出白色遮光板，调节仪器的零点和满刻度点。具体方法为：保持仪器在透射率测量模式（即仪器功能显示窗的“T”灯点亮），关上试样室盖时，屏幕 应显示“100.0”，如否，按下 “/100%/0A” 键，稍等片刻，仪器将显 示为 100.0（注意：本仪器采用了一键调整模式，不需连续按“/100%/0A” 键）；再将仪器转换到吸光度测量模

8、式（仪器功能显示窗的“A”灯点亮）， 将 A 值调为 0. 000（调节方式与调节透射率“T”的方式相同）。将测量模 式再转到透射率测量模式，打开试样室盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按 下“/0%”键，将透射率的底限设置为 0.0；（注意：不需对吸光度满刻度 进行校准。）(4) 改变测量波长，然后检查 320nm、700nm 处光能量。在该处透射率测量值应 显示高于 100%以上。如达不到要求时，应考虑更换光源灯或重新调整光源 灯位置。实验结果处理：观察对仪器检查的结果，如出现严重异常，则分析出现严重异常的原因，并根据原因做出必要的调整和修理。如果出现单色器波长的严 重偏差、聚焦不良等故

9、障，则可参考仪器的维修手册对单色器进行参数调整和 校正。如需更换光源灯，则须先拔掉仪器电源。新灯装入后应观察光源灯在入 射光孔和入射狭缝形成的现象。它在垂直方向应相对狭缝对称分布。然后再观 察左右对称情况及像斑是否清晰。2、单色器可见光波长的检测镨钕滤光片在 529nm12nm 处有较好的吸收峰，适用于光度计波长的细测。（1） 调波长(bchng)至 529nm 处，将仪器转换(zhunhun)到透射率测量模式（“T”灯点亮），调节仪器(yq)的零点和满刻度点（方法同实验内容 1 的步骤 3）。（2） 将镨钕滤光片插入光路，盖上样品仓盖，将仪器切换到吸光度测量模式， 测出这时的吸光度 A 值。

10、（3） 在 52910nm 附近每隔 1nm，各测其 A 值。（4） 将波长调节到 720nm。重新调节仪器的零点和满刻度点（方法同实验内 容 1 的步骤 3）。（5） 将仪器切换到透射比测量模式，从 790nm 开始，到 820nm 为止，每隔2nm 波长测一次透射比，在峰值波长：807nm 附近可每隔 1nm 做一次测 试。（注意在测量时，每改变一次波长，都要调节仪器的零点和满刻度 点）。实验结果处理：分别绘出在 529 和 807nm 处透射率谱图。对谱图进行分析，如在 529nm 1nm 或 807 1nm 处有吸光度的最大吸收峰则判定该仪器的波长 为合格。3、杂散光检测镨钕滤光片在

11、585 1nm 处吸光度 A 最大，透光率 T 最小，所产生的透光与 杂光成正比，因此可用其透光率表示杂光的大小。(1) 调波长为 585nm，打开样品仓盖，插入黑色遮光板，用黑纸挡住比色皿光路，盖上样品仓盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按“/0%”键，直至显示为 0.0为止；(2)打开样品仓盖，取出黑色遮光板，然后再盖上样品仓板，用空气作空白屏幕 应显示“100.0”，如否， 按下 “/100%/0A” 键，将透射率的满刻度调 整为“100.0”。(3)打开样品仓盖插入镨钕滤光片，盖上样品仓盖，测出 585nm 时的 T%，即为杂光水平。实验结果处理：如测得的在 585nm 处的透射率

12、T% 5%为合格。4、比色皿配套一套比色皿之间的材质、厚薄、色泽、空白吸收等应该一致，误差小于 0.5% 才能配套使用。 (1)选取几支大小、材质、色泽相同的比色皿，洗净，装入占比色皿体积 2/3 的蒸馏水(D.W.)，擦干，放入比色槽。(2) 拉动比色皿切换(qi hun)杆将第一支比色皿拉入测试光路中，盖上样品仓盖。（3）将波长(bchng)调节至 585nm 处，仪器测试(csh)模式切换到透射率测量模式，观察屏幕 上的透射率显示值，如不为“100.0”，则按下 “/100%/0A”键，将透射率的满度值调整为 100.0 为止；（4）拉动比色皿切换杆，将其他比色皿依次拉入测量光路，直接测

13、出其他几支 比色皿的 T%（在测量过程中不要对 T 值调 100%）。实验结果处理：Tmax %Tmin% 0. 5%为合格比色皿配套。不合格的需反复剔除极端值，或重新配对，直至有 2 个以上的比色皿合格。5单色器紫外波段波长的检测钛玻璃片滤光片在紫外波段有多处较尖锐的吸收峰，适用于光度计紫外波段的 波长校准。（1） 调节波长至 260nm 处，将钛玻璃片滤光片插入光路。（2） 调节仪器的零点和满刻度点（方法同实验内容 1 的步骤 3）。（3） 将仪器切换到透射比测量模式，从 260nm 开始，到 400nm 为止，每隔2nm 波长测一次透射比，在峰值波长：278nm、287nm 、333nm

14、 和 360nm附近可每隔 1nm 做一次测试。实验结果处理：在 260nm400nm 波段应在 278 1 nm、287 1nm 、3331nm 和 360 1nm 处观察到尖锐的吸收峰，如偏差 3nm 以上则紫外波长判定 为不合格（钛玻璃因来源不同会有微小的差别）.6.吸收滤光片和干涉滤光片的滤波曲线的比较五、实验注意事项1、在杂光检测中，用于调 0%T 的黑纸片应完好无孔洞，否则会导致假合格现象。2、使用比色皿时，其盛装液体不能超过总体积的 2/3，也不宜少于 1/2，且在检 测前必须用擦镜纸将比色皿外的液体擦拭干净。六、实验数据分析1、320nm 波长处的光能量为 2.8；700nm

15、波长处的光能量为 42.3，可见：光能 靠紫外弱，靠红外强2、529nm 波长附近的 A 的分布：波 长/nm519520521522523524525526527528A0.3390.3480.3670.4160.4750.5100.5600.6050.6130.623波 长529530531532533534535536537538/nmA0.6520.6480.6310.6140.5630.5050.4190.3900.2710.179529nm波长附近的A的分布0.70.60.50.40.30.20.10519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 5

16、29 530 531 532 533 534 535 536 537 538807nm 波长(bchng)附近的 A 的分布(fnb)：波长792794796798800802804805806A19.514.411.89.056.635.713.713.072.02波长807808809810811812813814816A1.571.351.882.494.124.688.3810.119.1807nm波长(bchng)附近的A的分布35302520151050123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20A由图观之，得 529nm 波长处有最大吸收峰

17、，该仪器波长合格。3、585nm 处的透射率为 0.385%，仪器合格4、测量不同比色皿中的 T 值：T（%）99.999.499.5Tmax %Tmin% =0.5% 0. 5% 为合格比色皿配套六、 思考(sko)与讨论1. 为什么采用黄色光作为(zuwi)单色器波长粗测的测量光？ 答：这是由于可见光区域的黄光波(gungb)段比较狭窄，适用于光度计波长的粗测。2. 分析影响波长测量精度的各项影响因素 答：分光光度计的测量精度主要取决于以下的因素：单色光波长的准确性， 所测定的透射率和吸光度测量值的准确性，以及杂散光的影响。3. 为什么选用镨钕滤光片的截止波段作为杂散光的测量依据？ 答：镨

18、钕滤光片是一种含有稀有金属镨(pr)和钕(Nd)的玻璃制品。它具有固 定的光谱吸收特性,性能稳定，在波长 400900nm 范围内有 14 个强弱不同的 吸收峰,其中在 529nm，741nm 和 807.7nm 处的吸收峰峰形尖锐,峰位准确.因 而它们可用于校正分光光度计的可见光段的波长;而紫外波段可使用钛玻璃 片，它在 279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm 处有比较尖锐的吸收峰。4. 透射率的 100%校准有时用空气作为透射媒介，有时用空白蒸馏水作为透射媒 介，这两者有什么区别？ 答：用空气作为媒介时没有考虑背景吸收的影响，而空白蒸馏水则排除了背 景吸收的影响。5. 吸收滤光片在光谱曲线上有什