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1、槲皮素与人血清白蛋白作用机理王欢,王姣,蒲小华,李宗孝( 陕西省植物化学重点实验室,陕西宝鸡 721013)摘 要: 采用荧光光谱、紫外吸收光谱、分子模拟等技术,研究了槲皮素与人血清白蛋白(HSA)相互作用的热力学行为。荧光实验结果表明:槲皮素与HSA相互作用时,随着槲皮素的浓度从0增加到19.6210-7 mol/L,HAS的荧光强度从844.3下降到461.4,最大发射波长由340.7 nm降低到338.6 nm,变化不明显,并且随着温度从298K升高到303K,猝灭常数由4.66 105 L/mol减小到2.69 105 L/mol,说明槲皮素对HSA的内源荧光有明显的猝灭作用,猝灭机理

2、为静态猝灭。分子模拟结果显示:槲皮素分子在HAS 的Sudlow I位点和Sudlow II位点的结合最高积分别为6.41和7.36,总能量分别为 -37.01 kJ/mol和-39.98 kJ/mol,表明其在Sudlow II位点的结合能力较强,且两种结合的作用力主要为氢键作用(键能分别为- 10.41 kJ/mol和-12.34 kJ/mol)。在位点I和位点II上,槲皮素分子与发光氨基酸残基Trp214的质心距离分别为1.36和2.40 nm。这与根据Frsters非辐射能量转移理论计算的平均距离3.04 nm结果基本吻合。关键词:人血清白蛋白;荧光光谱;分子模拟技术;槲皮素;静态猝灭

3、中图分类号:O657.3 文献标识码:A Study on the Mechanism between Quercetin and Human serum albuminWANG Huan, WANG Jiao, PU Xiao-hua, LI Zong-xiao*(Shannxi Key Laboratory of Phytochemistry,Baoji, Shaanxi 721013, China)Abstract: The thermodynamic behavior of the interaction between Quercetin and HSA is investigate

4、d by FS, UVS and MS. In fluorescence experiments, The interaction of quercetin and HSA, with C (quercetin) increased from 0 to 19.6210-7 mol/L, the fluorescence intensity of HAS decreased from 844.3 to 461.4, the maximum emission wavelength from 340.7 nm to 338.6 nm, did not change significantly, an

5、d as the temperature increases from 298K to 303K, the quenching constant decreases from 4.66105 L/mol to 2.69105 L/mol the fluorescence intensity of HSA obviously decreases with the increase of quercetin concentration, but the maximum emission wavelength has no obvious displacement, and the quenchin

6、g constant decreases with the raising of temperature. The results show that quercetin can strongly quench intrinsic fluorescence of HSA and quenching mechanism of quercetin with HSA is mainly a static quenching. In molecular simulation experiments, the quercetin molecule on Sudlows sites I and Sudlo

7、ws sites II with the highest point are 6.41 and 7.36, in a total energy of -37.01 kJ/mol and -39.98 kJ/mol respectively, show stronger binding on site II and hydrogen bonding interactions are the major forces(bond energies are -10.41 kJ/mol and -12.34 kJ/mol respectively). And on the site I and site

8、 II, the distances from quercetin to the center position of fluorescent amino acid residues Trp214 are 1.36 and 2.40 nm, which are in agreement with the distance (3.04 nm) of calculated by the Frsters non-radiative energy transfer theory.Key words: HSA; fluorescence; molecular simulation; Quercetin;

9、 static quenchingFoundation items: the Key Laboratory of Shannxi Province(12JS006); Education Department of Shaanxi Provincial Government (14JK1045).基金项目: 陕西省重点实验室项目 (12JS006);陕西省教育厅项目(14JK1045)作者简介:王欢(1991.11),男,硕士研究生,硕士学位。联系人:李宗孝,教授,电话E-mail: 近年来,国内外对天然药物槲皮素的生理活性进行了大量研究,结果表明:槲皮素是一种生理及

10、药理活性显著的多羟基黄酮类化合物,广泛存在于蔬菜、水果与油中。结构相对简单,具有止咳、祛痰、抗炎、抗过敏、抗菌、抗氧化和心血管保护作用,可用作食用黄色素和天然染料,能够降低血脂、增加冠状动脉血流量,对治疗冠心病和高血压具有辅助作用,并对恶性肿瘤的治疗和预防具有明显作用1-5。大量研究发现,槲皮素对诸如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等具有良好的治疗效果,并对艾氏腹水癌细胞DNA转录与翻译、RNA的表达和蛋白激酶的活性具有明显的抑制,以此抑制癌细胞的生长和转移,促进癌细胞的凋亡6。药物进入生物体内,需要通过血液进行运输并转运至病灶部位。人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)含有3

11、5个半胱氨酸,其中34个形成了17个二硫键,这些二硫键的存在固定了肽链的相对位置,稳定了蛋白质空间结构,对HSA 发挥正常的生理功能有着重要的作用6,它由585个氨基酸残基组成,主要由多个-螺旋构成,兼具结合和运输很多内源性和外源性物质的作用7-13。在维持生物体血液酸碱平衡、催化药物活性、清除自由基、抗凝作用、酶活性、酶抑制剂活性、运输内源性(如胆红素及脂肪酸)和外源性(如药物和外源性化学物质)物质等方面发挥了重要作用14-15。申炳俊16等,在模拟生理条时发现,香豆酸(p-CA)与人血清白蛋白(HSA)的结合机制为静态猝灭,并伴有非辐射能量转移,二者之结合主要为静电引力;黄汉昌17等采用紫

12、外法研究了芦丁与(HSA)结合方式,发现(HSA)引起了芦丁紫外可见光谱波峰红移,但并未引起(HSA)二级结构改变;朱美霖18等研究了不同温度下没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与(HSA)的相互作用,得到了静态猝灭常数及结合常数,发现该结合为自由能降低的自发过程。而研究槲皮素分子与人血清白蛋白(HSA)的结合,将是药物动力学及临床医学的重要内容。它有助于从分子水平深入了解其发挥药效活性的途径和作用,对阐述槲皮素在生物体内的输送和代谢,对受体释放,避免药物迅速代谢,对其毒理学、安全风险及了解槲皮素分子在人体内的评估具有较高的借鉴意义。1、实验部分1.1试剂与仪器槲皮素(质量分数98 %)为方晟

13、生物开发有限公司;人血清白蛋白(质量分数为99 %)、三羟甲基氨基甲烷等均为Sigma公司产品;实验用水为超纯水(18.2 M/cm,25 oC)。RF-5301 PC荧光光度计、UV-2550紫外可见分光光度计,日本Shimadzu公司; Milli-Q Advantage A10超纯水系统,美国Millipore公司。1.2实验方法1.2.1溶液配置HSA等溶液均用pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液配制,所有溶液于冰箱中4 oC避光保存。1.2.2荧光光谱设定激发波长ex=280 nm,激发与发射狭缝宽度都为5 nm,测得体系pH=7.4时的荧光光谱。模拟人体环境,固定HSA浓度(1.

14、4510-6 mol/L),逐步增加槲皮素浓度依次为0 、2.2010-7、4.3910-7、6.5810-7、8.7610-7、1.09510-6、1.31210-6、1.52910-6、1.74610-6、1.96210-6 mol/L,分别记录温度在293、298、303 K下的荧光发射光谱。1.2.3紫外吸收光谱273K下,以Tris-HCl缓冲液为参比,浓度为1.4510-6 mol/L的槲皮素溶液为样品,测定波长在200350 nm范围内槲皮素溶液的吸收光谱。1.2.4分子模拟技术人血清白蛋白(HSA)的晶体结构由RSCB Protein Data Bank获得,使用Sybyl 8

15、.1软件中的Biopolymer Prepare Suite程序对HSA的晶体结构进行分析准备,移除晶体水分子以及小分子配体,添加氢键取向的氢原子,计算并添加AMBER7FF99电荷。与梣酮分子的分子对接由suflex dock软件完成。对接结果通过vmd软件进行分析。2结果与讨论2.1荧光猝灭机理及猝灭常数依据1.2.1方法,得到荧光结果图1,其中aj分别表示槲皮素的浓度分别为0 、2.2010-7、4.3910-7、6.5810-7、8.7610-7、1.09510-6、1.31210-6、1.52910-6、1.74610-6、1.96210-6 mol/L。图1 加入不同浓度槲皮素后H

16、SA的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of HSA (1.4510-6 mol/L) with presence of various concentrations of Quercetin.; 由图1可知,HSA在338 nm(ex= 280 nm)有荧光现象产生,主要是因为在HSA亚域IIA中存在Trp214。药物与HSA相互作用,导致其内源荧光强度的下降,即表现出荧光猝灭现象。图1中,荧光强度随着槲皮素浓度的增加而明显下降,但其最大发射波长位置并没有明显的移动,这表明槲皮素可以有效地猝灭HSA的内源荧光19。采用Stern-Volmer方程,计算不同温度下槲

17、皮素对HSA 的猝灭常数: (1)式中,F0和F为非存在和存在猝灭剂时的荧光强度;Q为猝灭剂的浓度(mol/L),Ksv即Stern-Volmer猝灭常数(L/mol),;Kq为表观双分子猝灭的速率常数L/(mols);0表示不存在猝灭剂时生物大分子的平均荧光寿命5.71 10-9 s。对动态猝灭,受碰撞几率的限制,不同种类猝灭剂的最大碰撞猝灭速率常数通常不大于2.01010 (L/mols)20。按(1)式计算结果见图2及表1。图2 不同温度下药物槲皮素与HSA作用的Stern-Volmer关系图Fig.2 Stern-Volmer plots for the interaction of

18、Quercetin and HSA at different temperatures表1不同温度下药物槲皮素对HSA作用的Stern-Volmer猝灭常数Table 1 Ksv and Kq of Quercetin and HSA interaction system at different temperaturesT/KKsv/(L/mol)Kq(L/mols)R22934.66 1058.16 10130.99782984.17 1057.30 10130.99883032.69 1054.71 10130.9991一般而言, Ksv随温度上升而减小为静态猝灭;与此相反, Ksv随温

19、度升高而增大为动态猝灭。由图2可知在pH = 7.4 时,在温度分别为293、298、303K时,所对应的直线斜率即猝灭常数随温度的升高呈降低趋势,随着温度的升高猝灭常数减小,且Kq远大于最大扩散碰撞猝灭速率常数(2.01010 L/mol/s),表明槲皮素对HSA的荧光猝灭机理为静态猝灭,这是两者之间形成无荧光配合物的缘故。2.2热力学参数与作用力类型为了进一步确定不同温度下槲皮素对HSA作用的结合常数及热力学参数,对静态猝灭过程,可用修正的Stern-Volmer方程对其荧光猝灭数据进行处理: (2)以对作图,即可求得HSA与药物槲皮素的结合常数Ka。利用Vant Hoff 方程,可计算反

20、应的焓变H 和熵变S: (3)式中K 为对应该温度下的结合常数;R 为摩尔气体常数。根据计算出焓变H和熵变S,可计算出槲皮素与HSA反应的吉布斯自由能变化: (4)根据方程(2)、(3)和(4)计算所得的热力学函数,列于表2中。表2 不同温度下药物槲皮素对HSA作用的结合常数及热力学函数Table 2 Binding constants and thermodynamic function of Quercetin-HSA system at different temperatureT/KnKa/(L/ mol)H/(kJ/mol)G/(kJ/mol)S/(J/molK)2930.941.4

21、2 106-81.49-34.52159.412980.861.08 106-34.433031.130.47 106-32.92由表2可看出,槲皮素与HSA结合过程的H 0,说明系统的无序度增大,有利于反应进行;计算得到的G0,所有结果显示该过程是一个熵焓协同驱动的自发过程。这个反应中所产生的熵变,有可能是微环境的改变和蛋白质部分氨基酸残基去溶剂化造成的21-22。图3为不同温度下药物槲皮素与HSA作用的修正Stern-Volmer曲线图3 不同温度下药物槲皮素与HSA作用的修正Stern-Volmer曲线Fig.3 Modified Stern-Volmer of Quercetin an

22、d HSA at different temperature由图3可以看出,当温度分别为293、298、303K时,温度越高,HSA与药物槲皮素的结合常数Ka越小。2.3 能量转移与结合距离Forster非能量转移理论通常被用来估计配体与蛋白质色氨酸部分的距离。根据Frsters非能量转移理论,供体和受体之间的能量转移效率(E)可用以下公式(5)计算: (5)图4是HSA与槲皮素的荧光光谱和吸收光谱重叠图 图4 HSA与槲皮素的荧光光谱和吸收光谱重叠图Fig .4 Spectral overlap of the absorption spetra of Quercetin with the f

23、luorescence spectra of HSA,c(HSA)=c(Quercetin)= 1.4510-6 mol/L. 式中,F0和F代表非存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度;r 表示受体与供体之间的平均距离;R0表示能量转移效率是50 %时的供体与受体之间的临界距离。R0可通过如下的方程来计算: (6)K2指的是供体-受体偶极的空间取向因子,取平均值2/3;n为介质折射常数,取1.336;为供体的荧光量子产率,按照0.15计算;J为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分,可由下式求出: (7)F()为荧光给体在波长处的荧光强度,()为受体在波长处的摩尔吸光系数。J 值可根据方程7

24、通过图5中的重叠光谱计算。通过以上三个方程的计算,可得到:Quercetin -HSA(1:1),J = 1.92 10-14 cm3L/mol,R0 =2.81nm,E=0.386,r= 3.04 nm; r值在28 nm 之间,而且符合0.5R0 r 1.5R0,说明非辐射能量转移确实可在HSA与槲皮素之间发生,并且非常符合Frsters非辐射能量转移理论的预测23。2.4 分子模拟采用1.2.4分子对接方法进行槲皮素和HSA的对接计算,结果如图5所示:确定为彩图图 5槲皮素对HSA的三维结构分子对接Fig.5 Molecular docking of Quercetin on the t

25、hree-dimensional structure of HSA. (Panel of a and c show the residues of HSA interacting with Quercetin at subdomain IIA and subdomain IIIA. Panel b and d show the residues of HSA interactions)槲皮素分子在位点I和位点II的结合最高积分分别为6.41和7.36,总能量分别为 -37.01kJ/mol和-39.98 kJ/mol,表明在位点II的结合更强,槲皮素与蛋白之间存在强的极性作用。如图5所示,Si

26、te I: 结合位点5以内的氨基酸残基包括GLU153,PHE156,PHE157,ARG160,GLU188,ALA191,LYS195,LYS199,HIS288,GLU292,ASP451。槲皮素的羟基与GLU153,GLU88,ASP451形成氢键,环上的氧原子与LYS195的侧链形成氢键,能量为-10.41 kJ/mol。Site II:槲皮素结合在螺旋形成的空腔当中,发现周围的氨基酸残基包括:LEU387,ASN391,ARG410,LYS414,LEU453,ARG485,SER489,PHE488,LEU491,GLU492。槲皮素分子的羟基与ASN391和GLU492的极性侧

27、链形成氢键,与ARG485和LEU491主链上的氧原子形成氢键,能量为 -12.34 kJ/mol。在位点I和位点II槲皮素分子与发光氨基酸残基Trp214的质心距离分别为1.36和2.40 nm。槲皮素作为抗癌药物,一般都要经过一个血浆储存和运输的过程才能达到受体部位发挥生理功能,其与HSA以较低的结合能发生作用,这种结合的主要作用力是氢键作用,不需外界供给特殊能量,并且药效受到与HSA 结合作用的影响。显然,可依据此特性从结构修饰,或是借助其他物理手段保护入手,来提高药物在临床应用中的安全性和高效性,并且研究药物与HSA 相互作用模式,对新药发现和药理学来说,是非常重要和紧迫的。3、结论槲

28、皮素与HSA相互作用时以氢键作用为主导,同时槲皮素对HSA的内源荧光有明显的猝灭作用,猝灭机理为静态猝灭。分子模拟显示,槲皮素在HAS的位点I和位点II上,与发光氨基酸残基Trp214的质心距离分别为1.36 nm和2.40 nm。这些结果对初步阐明了槲皮素与HSA的结合机制,为进一步研究槲皮素与HSA奠定了基础。特别是分子模拟技术的使用,对揭示人血清白蛋白与药物作用将产生重要意义。参考文献1 Zhao L, Wu J, Wang Y, et al. Cholesterol metabolism is modulated by quercetin in ratsJ.Journal of agr

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