2012CB944900 辅助生殖诱发胚胎源性疾病的风险评估和机制研究汇编

1、项目名称：辅助生殖诱发胚胎源性疾病的风险评估和机制研究首席科学家：黄荷凤浙江大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部浙江省科技厅一、关键科学问题及研究内容（一）关键科学问题面对严重危害人类健康的重大疾病发生率高、发病机制不清、源头防治困难的挑战，以及辅助生殖出生子代已成为新人口重要组成部分、远期风险亟待评估的现状，结合慢性成年期疾病胚胎起源的新学说，依据小鼠实验已证实ART可引起子代高血压和糖代谢异常，以及ART子代低出生体重和出生缺陷显著增高的事实，本项目拟解决的关键科学问题为：人类辅助生殖技术及父/母源性生殖障碍是否干扰配子发生/胚胎早期发育而增加子代胚胎源性疾病风险？相关

2、发病机制如何？1、辅助生殖技术及父/母源性生殖障碍是否干扰配子发生/胚胎早期发育？其关键因素、作用时间窗、作用途径如何？2、干扰配子发生/胚胎早期发育是否增加子代糖尿病、心血管疾病等胚胎源性疾病风险及生育力低下的易感性？相应机制如何？是否存在传代效应？3、胚胎源性疾病是否有相应生物预警标记物？消减孕前不良暴露或实施出生后干预可否降低胚胎源性疾病的发病风险？（二）研究内容：胚胎源性疾病发病机制不清，辅助生殖技术本身的非生理性操作、生殖障碍疾病的不良环境暴露及这些因素间的相互作用干扰配子发生和早期胚胎发育，为研究人类成年期疾病的胚胎起源提供了突破口。本项目围绕关键科学问题，主要研究内容为：1、对人

3、类ART子代进行健康追踪研究，评估ART技术本身及PCOS和子宫内膜异位症不良生殖内环境增加子代糖尿病、心血管病的风险，以及严重少弱畸精症子代生育力低下的风险；结合动物/体外模型研究，鉴别可能诱发子代胚胎源性疾病的高风险ART技术（如卵巢刺激、胚胎培养、胚胎冻存）、关键因素（父/母源性不良生殖背景、卵巢局部微环境、宫内环境等）、作用时间窗（配子发生、早期胚胎发育阶段）及传代效应，分析不同ART技术方案诱发胚胎源性疾病的风险程度。2、利用人类ART临床资源、动物模型和体外模型，获取配子、植入前胚胎、以及动物宫内至出生后子代各个时期靶器官组织标本，应用基因组学、蛋白组学、表观遗传组学等高通量分子技

4、术联合生物信息分析，研究不同ART方案所致发育阶段特异和组织器官特异的基因/蛋白/表观遗传改变，筛选出与子代胚胎源性疾病发生相关的重要候选基因、相应表观遗传改变及生物预警标记物。3、利用ART哺乳类动物模型和胚胎干细胞体外分化模型，研究ART致早期胚胎表观遗传修饰改变的特性，分析其对子代的近远期影响及与成年期发病之间的关系，探索优化的ART技术体系；利用PCOS动物模型、条件性基因敲除小鼠模型、转基因斑马鱼模式动物，研究干扰配子发生/胚胎早期发育诱发胚胎源性疾病的主要作用途径、关键信号通路、表观遗传机制及其他分子机制，探索消减胚胎源性疾病风险的靶点。二、预期目标（一）总体目标瞄准国家战略需求和

5、生殖与发育研究前沿，围绕配子发生和早期胚胎发育阶段的干扰是否诱发胚胎源性疾病的核心科学问题，以ART和生殖障碍疾病作为主要干扰因素，研究胚胎源性疾病的发生机制、病理生理过程和防控策略。运用基因组学、蛋白质组学、表观遗传组学和生物信息学等现代生物学技术，系统评估辅助生殖主流技术、生殖相关疾病不良遗传背景和不良生殖内环境对配子发生、早期胚胎发育干扰所致胚胎源性疾病的风险因素，探明关键窗口期，主要表观遗传异常的分子事件和传代效应；以糖尿病、心血管疾病等作为候选胚胎源性疾病，通过探索其发病过程中的信号转导通路、表观遗传机制及其他分子机制，发现有效的预警分子标记物和易感人群，为源头防控胚胎源性疾病、减少

6、出生缺陷、优化ART提供科学依据。通过本课题的实施，使发育源性疾病（如糖尿病和心血管病等人类重大疾病）在配子/胚胎层面有发病机制上的理论突破，使ART的远期安全性评估有科学依据，获得一批有自主知识产权的成果，同时以本项目的实施为契机,促进生殖医学、生殖生物学、发育生物学、表观遗传学和代谢病研究的衔接和交叉集成，培养一批临床应用基础研究与基础研究相结合的复合型人才，使我国的生殖健康研究领域跻身国际领先行列。（二）五年预期目标1、通过ART出生子代健康追踪研究，筛选发生低体重、糖/代谢异常和表观遗传修饰异常的主要ART干扰因素，明晰辅助生殖技术本身或合并父/母源性生殖障碍诱发糖尿病、心血管疾病等胚

7、胎源性疾病的风险度，识别增加疾病易感性的生殖障碍疾病因素。2、结合临床资源、动物模型、体外模型和模式动物研究，识别配子发生/早期胚胎阶段至成年期疾病相关基因/蛋白和表观遗传差异，明确引起异常的主要高危ART技术、关键因素和作用时间窗，阐明ART相关干扰对子代的近远期影响以及传代效应，3、明确相关候选基因/蛋白和相应表观遗传改变与成年期发生胚胎源性疾病的关联性，确定ART相关干扰诱发胚胎源性疾病及生育力低下的主要致病窗口期、主要表观遗传异常的分子机制，建立规避风险的ART技术措施和适应症规范。4、阐明ART相关干扰所致相关异常引发糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的主要作用途径、具体信号通路和表观遗

8、传修饰机制，鉴定数个疾病相关的关键基因/蛋白和表观遗传异常的分子事件，筛选可进行有效疾病预警的分子标记。5、利用疾病预警分子标记，检出易感人群，建立消减胚胎源性疾病发病风险的出生后饮食/生活方式。6、培养一批生殖与发育领域具国际视野的优秀人才，取得具有国际影响的原创性成果；在国际重要学术刊物上发表SCI论文50篇以上，争取多篇高影响因子的论文发表，取得若干项国际或国家发明专利。建立国内一流、国际领先的生殖安全研究基地和转化医学基地，使我国的生殖健康研究领域跻身国际前列。三、研究方案（一）总体研究思路成年期重大疾病的生命早期起源学说自提出之日起就受到了广大临床和基础研究科学家的高度关注。然而，由

9、于伦理和技术限制，对人类发育源性疾病的在体直接研究非常困难，以往只能借助于流行病学调查和动物模型实验，主要研究宫内不良环境所致胎儿源性成人疾病的可能机制。但更值得关注的是，疾病的早期起源可以追溯至胚胎甚至配子发育时期，因此，阐明干扰配子发生/胚胎早期发育引起胚胎源性成人性疾病的发生机制，对于疾病诊治前移、源头防控具有更加重大的意义。随着辅助生殖技术的高速发展，人类配子和胚胎在实验室的可操作性使得在体外模拟人体内配子发生/胚胎发育的内源性（如遗传、表观遗传）和外源性（内外环境）因素成为可能；此外，全基因组关联分析（GWAS）、MeDIP-chip、Chip-chip、microRNA等新技术的应

10、用极大推动了基因组学包括遗传学和表观遗传学研究的进展。本项目在全世界率先提出和建立以临床辅助生殖为技术平台，以基因组学包括遗传学和表观遗传学研究最新技术在内的相关方法学为研究手段，以人配子和胚胎为主要研究对象，以辅助生殖出生子代为成人性疾病发生结局的载体，将发病率高、危害重大的慢性成人性疾病发生发展机制研究的关注点前移至配子发生/胚胎早期发育阶段，具有致病机制研究思路创新性和疾病防治策略的前瞻性。因此，本项目设计ART及相关的生殖障碍疾病干扰配子发生和胚胎发育诱发胚胎源性疾病的风险评估和机制研究，是生殖与发育领域前沿的崭新研究课题。不仅能回答人类发育源性糖尿病、心血管病等发病机制方面的重大科学

11、问题，同时对促进人类现代生殖科技的进步有重大科学意义。根据总体学术思路，本项目研究的技术线路如图所示。具体而言，本项目将通过人类辅助生殖子代健康追踪，利用模式动物、动物模型，与自然妊娠子代比较，研究促超排卵药物、体外培养和配子胚胎冻融等ART主流技术出生子代，以及PCOS、子宫内膜异位症、严重少弱精症等父/母源性生殖障碍患者ART子代的生长发育、糖/脂代谢、心血管结构功能、性成熟等表型特征；探索不同ART技术诱发上述疾病的风险程度，以及父/母源性生殖障碍疾病背景是否增加疾病的易感性；分析人类ART子代与糖尿病、心血管疾病相关的基因/蛋白表达调控的差异。同时利用动物模型和体外模型研究平台，通过基

12、因组学、蛋白质组学、表观遗传组学等高通量和生物信息学分析方法，分析配子发生/早期胚胎阶段的表观遗传异常、子代DNA突变、不同发育阶段重要靶器官组织相关基因/蛋白表达、重要候选基因调控区DNA甲基化、染色质组蛋白甲基化/乙酰化以及小RNA修饰等表观遗传修饰异常，探明ART相关干扰诱发胚胎源性疾病的关键时间节点、致病窗口期、主要风险因素、主要表观遗传修饰异常的分子事件，明确相关干扰对子代的近远期影响以及传代效应。在上述研究工作基础上，利用模式动物、胚胎干细胞体外分化模型，剖析辅助生殖相关干扰诱发糖尿病、心血管病和低生育力的主要候选基因/蛋白和信号通路，重点研究糖尿病相关转录因子pdx-1、葡萄糖转

13、运基因glu-4、信号通路分子PI3K/PKC/IRS-1，心血管疾病相关eNOS/NO、PGI2、Endothelin、TXA2以及精子组蛋白泛素化去泛素化（UPP）系统在胚胎源性疾病发生发展中的作用，深入阐明辅助生殖干扰配子发生、早期胚胎发育所致相关异常引发上述胚源性疾病的具体信号转导通路、重要候选基因表观遗传修饰机制及其他分子机制，发现相应的预警生物分子标记物。利用预警生物标记，检出易感人群，探寻优化ART和消减胚胎源性疾病发病风险的技术措施/营养方式，实现胚胎源性疾病的防治前移。严格遗应症，提商辅助生殖技术安全性胚胎源性疾病凤险评估技术疾病子代追踪研究f异常表塑Z动物/体外模型糖尿病、

14、心血管病生育力低下配子发生/早期胚胎炭育候选基因/高通量分子披术f蛋韵表观f遗传改变分子机制f胚胎源性疾病发生机制生物预警标记胚胎源性疾病的防治前移项目的可行性分析1、项目实施有坚实的理论依据：“胎儿源性成人疾病”理论已获公认，但与胎儿发育相比，配子的发生和成熟受潜在危害的作用时间更长；受精及胚胎期（受精6周内）处于表观遗传重编程和细胞快速分化及器官形成期，是环境干扰致病的最敏感阶段。本项目将成人期疾病的发生关注点进一步前移至配子发生和胚胎发育期，具有取得重大理论突破和研究进展的可行性。2、具有动物实验依据：小鼠ART模型已证实ART可引起成年后小鼠高血压和糖代谢异常，为本项目人类ART诱发胚

15、胎源性疾病研究提供了最直接的支持。3、前期研究基础扎实：本项目组前期研究已证实ART子代表观遗传修饰异常增加及出现新发基因突变，而表观遗传修饰异常是代谢性疾病的主要发病机制之一。因此，在此基础上进一步进行胚胎源性疾病发生机制研究有望取得突破性成果。4、ART子代低出生体重为胚胎源性疾病发生提供切入点：已证实低出生体重是胎儿源性心血管疾病和糖尿病等的独立高风险因素。而ART子代低出生体重发生率显著增高，因此以低出生体重为切入点研究ART诱发的胚胎源性疾病发生机制研究，极有可能获得胚胎源性疾病发病机制研究的重大突破。5、研究团队实力雄厚：项目组汇集了生殖、发育、代谢性疾病与生物信息学等相关领域的优

16、势力量，多学科交叉、优势互补，已建立了长期合作的协作关系；临床资源丰富、研究平台完善，为项目的顺利完成提供了可靠的保障。（二）创新点1、本项目瞄准生命科学国际前沿和生殖与发育学科的新兴领域，从配子发生和胚胎早期发育层面探索胚胎源性成人疾病的发病机制，将宫内“胎儿源性成人疾病”的研究前移到配子和胚胎发育早期的“胚胎源性成人疾病”，具有学术思想的创新性。2、利用人类ART的技术特征和父/母源性生殖障碍疾病致生殖细胞特异不良内环境暴露作为胚胎源性成人疾病的独特研究模型，以表观遗传/基因/蛋白组学为新视角，结合模式动物、体外模型研究，甄别ART诱发胚胎源性疾病的高危技术风险和致病易感性、并阐明其传代效

17、应，具有研究对象和技术途径的新颖性。3、以发病率高、危害重大的糖尿病和心血管疾病以及影响人类繁衍的生育力异常作为主要候选疾病，通过鉴定ART诱发胚胎源性疾病的关键候选蛋白/基因，发现有效预警胚胎源性疾病的生物标记，探索可行的早期防治策略，为重大疾病防控前移战略提供新的科学依据。（三）课题设置以及课题间的相互关系围绕配子发生和胚胎发育阶段的ART环境暴露是否以及如何诱发胚胎源性疾病的发生这个关键科学问题，本项目设置了三个课题：课题1：辅助生殖致胚胎源性疾病的技术风险因素研究主要研究内容：1、人类ART子代健康追踪研究以自然妊娠子代为对照，追踪超促排卵、胚胎体外培养和胚胎冷冻复苏等人类辅助生殖主流

18、技术出生子代，特别是低出生体重(lowbirthweight,LBW)及小于胎龄儿(smallforgestationalage，SGA)的子代，测定空腹和餐后血糖、胰岛素水平、糖耐量试验和胰岛素抵抗指数等糖代谢指标，评估罹患糖尿病的风险；通过血压、主动脉及颈动脉厚度、内膜中层厚度、弹性以及心脏几何结构和舒张功能等心血管结构与功能指标，以及血管活性物质NO、PGI2、TXA2、Endothelin等血管内皮舒缩功能指标，评估罹患心血管病风险；检查青春期第二性征、性激素水平等性发育表型指标，以及检测与配子发生、成熟和生育力密切相关的基因(AZF、GDF-9等)突变与表观遗传修饰的变化，评估子代生

19、育力是否受到明显影响。2、人类ART子代胚胎源性疾病相关基因/蛋白研究获取ART子代的胎盘、脐血外周血等临床资源，将低出生体重ART子代与正常体重ART子代、自然妊娠子代作为同期对照，进一步对不同促排卵方案、胚胎体外培养环境、胚胎冻融方式及冻存时间出生子代进行比较，采用基因芯片和蛋白组学筛选差异表达基因/蛋白，结合生物信息学分析筛选出与糖尿病、心血管疾病和生育力低下等疾病相关的重要候选基因以及生物预警标记。利用甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术，检测全基因组DNA或特定位点的甲基化控制区；利用组蛋白乙酰化免疫共沉淀测序(ChlP-seq)技术检测组蛋白修饰(乙酰化/甲基化)位点或控

20、制区域，比较表观遗传修饰(DNA甲基化、组蛋白修饰、基因印记)差异，研究ART子代发生表观遗传修饰改变的规律性，结合生物信息学方法，筛选相应调控的基因(包括印记基因及非印记基因)，进一步验证表观遗传修饰改变对基因表达的影响。3、ART动物模型和体外模型研究建立不同ART技术的动物模型和体外模型，对超促排卵、胚胎体外培养、胚胎冻融分别进行单因素研究，评估不同ART技术出生子代体重、生长发育、糖脂代谢指标、血压、生育力等，明确罹患糖尿病、心血管疾病和生育力低下等疾病风险。将不同ART方式出生子代与正常妊娠子代相互交配，出生子二代，评估ART子二代生长发育及代谢等相关指标，明确ART所致胚胎源性疾病

21、的传代风险及亲源性遗传特征。获取ART动物不同发育阶段配子、胚胎，结合体外培养模型，研究促排卵影响卵子发生过程表观遗传重编程、尤其是基因印记重建时序性的关键时间窗，探索胚胎培养、冻存等影响植入前胚胎去甲基化和新发甲基化等表观遗传修饰的关键因素；获取ART模型不同胎龄的胚胎组织，分析亚稳态表等位基因(metastableepialleles)表达，确定子代受影响的时间窗；采用高通量技术比较全基因组甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化等表观遗传修饰变化，重点研究ART所致的早期胚胎印记丢失(lossofimprinting)或印记松弛(relaxationofimprinting)等基因转录微环境的改变；

22、获取ART动物出生后子一代和子二代不同组织器官(胰腺、肝脏、心脏、血管、性腺等)标本，筛选糖尿病、心血管疾病和生殖障碍相关差异基因/蛋白。通过数据挖掘分析，明确ART中高风险技术因素及相应生物预警分子标记。研究目标：通过辅助生殖主流技术诱发糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的风险评估和干扰配子/胚胎发育机制研究，明确ART技术干扰影响配子发生和胚胎发育的高危因素及关键时间窗；筛选出超促排卵、体外培养和冻融技术致相关疾病的靶基因及生物预警标记。承担单位：浙江大学、中南大学课题负责人：黄荷凤学术骨干：卢光琇、金帆、陈新、谭跃球、徐晨明经费比例：33%课题2：父/母源性生殖障碍诱发胚胎源性疾病风险评估及

23、机制研究主要研究内容：1、生殖障碍患者ART子代健康追踪研究以同期匹配的单纯输卵管性不孕ART子代为对照组，跟踪观察生殖障碍（PCOS和子宫内膜异位症）、严重少弱畸精症患者经ART出生子代的健康状况。通过孕期B超监测宫内生长发育，特别关注胎儿生长受限（FGR）、LBW及SGA子代；检测不同年龄段子代血清糖代谢、脂代谢、血管内皮功能、生殖内分泌等相关指标；无创性检查心血管几何结构和功能，了解血管弹性及内皮舒张功能等，评估父/母源性生殖障碍疾病是否增加胚胎源性疾病的易感性。2、生殖障碍患者ART子代差异基因/蛋白研究获取PCOS、子宫内膜异位症和严重少弱畸精症等生殖障碍疾病患者经辅助生殖出生子代的

24、临床标本（如绒毛、羊水胎儿细胞、脐血、胎盘、外周血、唾液等），利用蛋白组学及全基因组表达谱芯片筛选差异表达的蛋白、印记基因与非印记基因，尤其是亚稳态表等位基因，分析相应生物学功能；应用现代生物信息学技术进行基因集合富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA）、分类预测分析（PredictionAnalysisforMicroarray,PAM）等，筛选发生显著性改变的信号通路或者关键基因集合，遴选出可用于早期诊断及预警的分子标志物。应用DNA直接测序法，检测生殖障碍患者ART子代与配子发生及与（糖尿病、心血管病、生育力低下等）胚胎源性疾病相关重要候选基因（AZF、G

25、DF-9、INSR等）的单核苷酸多态性（SNP），分析其与临床表型的关联性；应用SNP芯片、外显子组测序等技术，确定严重少弱畸精症主要基因变异对关键基因、蛋白的影响，重点研究（精子发生来源的、参与组蛋白和p53降解的）泛素化去泛素化（UPP）系统（包括Huwe1,USP2和USP19等分子)在辅助生殖过程中诱发胚胎源性疾病的作用和影响，尤其是对ICSI男性子代生育力的作用和影响。3、生殖障碍疾病模型及传代效应研究建立基于PCOS病理生理变化的动物模型和模拟子宫内膜异位症腹腔微环境的体外模型，结合模式动物和胚胎体外培养模型，观察子宫内膜异位症盆腔微环境、PCOS卵巢局部不良微环境、宫内高雄环境和

26、胰岛素抵抗等不良暴露因素诱发子代胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力降低的远期效应，以及对子二代的隔代遗传效应和亲源性遗传特征；获取配子、植入前胚胎、以及宫内至出生后发育各个时期靶器官组织标本(胰腺、肝脏、肌肉、脂肪、心脏、血管、性腺等)，动态研究胚胎源性疾病相关差异基因及蛋白表达的发育阶段特异性(stagespecificity)和组织器官特异性(tissuespecificity)，明确致病关键时间窗。重点研究父母源性生殖障碍背景对卵泡发育、卵子成熟及早期胚胎重编程的干扰，尤其是高雄激素内环境下KNDy、Kisspeptin和NKB信号系统对卵泡发育/成熟的负面影响。研究目标：明确排卵障碍性疾

27、病PCOS和子宫内膜异位症、严重少弱畸精症等父/母源性生殖障碍疾病是否增加辅助生殖诱发胚胎源性疾病易感性及其关键因素；揭示生殖障碍疾病影响配子发生和胚胎/胎儿发育的关键时期，发现相应的表观遗传修饰改变和相关重要基因。承担单位：南京医科大学、中国医学科学院基础医学研究所、浙江大学课题负责人：刘嘉茵学术骨干：王琳芳、祝辉、叶英辉、朱小明、宋伟经费比例：28.5%课题3：辅助生殖诱发胚胎源性疾病的发生机制研究主要研究内容：1、ART致早期胚胎表观遗传修饰改变的机制研究建立ART哺乳类动物模型，研究ART对哺乳类动物早期胚胎表观遗传修饰的影响及其对子代的近远期影响。利用胚胎干细胞体外分化模型及模式动物

28、，结合差异表达的基因功能，定性、定量地分析早期胚胎印记丢失对胎盘与胎儿发育、印记基因表达、新生个体生长发育以及成年期疾病的影响；重点研究体内与体外胚胎的差异，识别可指示早期胚胎质量的可溶性生物分子；分析不同生物因素对早期胚胎表观遗传修饰的干扰，探索能降低或避免早期胚胎表观遗传修饰改变的ART培养体系和生物因子组合。2、辅助生殖致胚胎源性糖尿病机制研究建立PCOS-ART动物模型和传代模型，分离低出生体重子代的胰腺和胰岛素靶器官（肝脏、肌肉和脂肪），采用高通量和生物信息学分析方法，筛选影响胰岛B细胞功能、靶器官糖原合成和葡萄糖利用的糖尿病相关重要候选基因（如调控B细胞增殖和分化的转录因子pdx-

29、1，参与葡萄糖转运的基因glu-4，及胰岛素下游信号通路分子PI3K,PKCIRS-1等），并在子一代、子二代进行甲基化差异和相应重要候选基因的表达差异验证。结合体外实验，研究ART相关干扰对胰岛B细胞数量、分泌功能及靶器官葡萄糖摄取、利用和糖原合成的影响，阐明ART出生小鼠子代和子二代发生糖尿病的风险，明确传代效应。建立候选基因的胰岛B细胞系过表达或敲减模型，检测ERK1/2,PI3K/Akt/Cyclin等参与细胞增殖的信号通路，p53、caspase等参与细胞凋亡的信号通路，以及sAC/cAMP等参与胰岛素合成和分泌的信号通路，确定候选基因参与B细胞增殖/凋亡、胰岛素合成/分泌的分子机制

30、；选择在效应最明显的胰岛素效应器官（如肝脏，肌肉或脂肪）的原代培养细胞或细胞系中，超表达或敲减候选基因，检测细胞对胰岛素的应答，例如效应细胞对葡萄糖的摄取和分泌速率、糖原合成速率、脂肪细胞的分化和代谢等,并证明候选基因的作用机制和信号途径。3、辅助生殖致胚胎源性心血管病机制研究结合课题1,2，确定ART子代出现心血管的年龄、表型，研究不同ART动物模型所致子代心血管系统改变，探索ART方案及父母健康异常对子代心血管系统的影响，通过比较心血管指标异常ART子代与正常子代血管（内皮细胞，平滑肌细胞）,心肌细胞内信号传导途径（包括关键因子基因调控）的异同，验证在ART子代人群中筛选出候选体液调节因子

31、和基因调控因子，阐明ART子代心血管异常发生机制。结合体外实验，在细胞水平研究ART药物、ART实施时细胞内环境因素对血管内皮细胞，血管平滑肌细胞生长迁移，血管内皮细胞源性舒缩血管因子（NO，ET等），血管平滑肌舒缩的影响极其机制；研究ART子代候选体液调节因子、基因调控因子及表观遗传改变所致心血管异常高危险的可能性极其机制。4、胚胎源性糖尿病、心血管病发病风险消减研究建立基于低出生体重的ART子代小鼠糖尿病/心血管病的诱导模型。在子代出生后，通过控制哺乳母鼠和断奶小鼠的蛋白质、糖、脂肪含量等的摄入量，观察出生后营养对ART子代糖尿病和心血管病相关指标（空腹和餐后血糖水平、胰岛素水平、糖耐量和

32、胰岛素抵抗指数以及血压、血管结构和动脉血管舒缩功能等）的影响，比较不同营养模式ART子代糖尿病和心血管病的发病率，以及重要候选基因和相关信号通路分子的表达，分析不同营养模式、重要候选基因及关键信号分子表达水平和发病之间的关联性，探索消减胚胎源性疾病发病风险的营养方式/生活方式，验证预测发病的分子标记物。5、ART子代生育力降低机制研究SNP基因芯片分析临床严重少弱畸精症患者的血液、精子样本及其ART子代脐血，调查其子代生育力降低的基因突变、拷贝数异常等遗传变异，研究这些变异与表观遗传学变化的关系，明确ART技术是否会造成遗传缺陷的累积传递。对于鉴定出的变异，通过模式生物（如转基因斑马鱼）识别这

33、类遗传变异是否是胚胎源性疾病的危险因子。结合课题组前期研究中发现的与精子组蛋白泛素化相关的重要蛋白Huwel、TRIM69，利用条件性基因敲除HuwelUSP2，USP19的小鼠模型，深入研究泛素化连接酶Huwel、TRIM69在精子发生、早期胚胎发育和DNA修复复合物泛素化调节中的作用，阐明ART相关干扰能否引起此类蛋白功能异常，诠释Huwel、TRIM69在子代精子功能、基因突变和表观遗传学改变中所起的作用，阐明ART相关干扰致子代生育力降低的可能分子机制。研究目标：揭示重要候选基因在胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力低下发病中的作用和机制，重点阐明表观遗传学修饰机制在ART诱发的胚胎源性疾

34、病中作用，通过建立有效预警的生物标志物，提出优化ART和早期防控胚胎源性疾病的策略。承担单位：浙江大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所、四川大学课题负责人：杨卫军学术骨干：陈小章、孙方臻、赵正言、盛建中、董旻岳、许文明、黄卫红经费比例：38.5%课题间的相互关系本项目的三个课题分别从ART技术因素、生殖障碍相关疾病因素对配子和胚胎的影响，以及相关胚胎源性疾病发生机制三个方面进行深入系统的研究，最终为胚胎源性疾病的防治和ART的优化提供科学依据。三个子课题以辅助生殖诱发胚胎源性疾病风险评估及发病机制研究为主线，在三个方面展开研究：课题1和课题2为并列关系，课题1以自然妊娠出生子代为对照，研究A

35、RT诱发胚胎源性疾病的技术风险因素；课题2结合课题1以输卵管阻塞性不孕ART子代为对照，研究母亲PCOS、子宫内膜异位症及父亲严重少弱畸精症是否增加ART诱导胚胎源性疾病和子代生育力低下的机率；课题3是对课题1，2的深入，进一步研究胚胎源性糖尿病和心血管疾病等以及ART致子代生育力降低的发生机制和传代效应。结合三个课题的研究结果，完成对发育源性疾病发病机制理论研究的突破，研究结果可为源头防控胚胎源性疾病、优化ART提供科学依据。五年目标为总体目标的分解，前两年完成主要科学发现，尤其关注临床助孕技术安全性的基础研究以及对子代随访资料的科学性和完整性进行完善，并对研究内容进行适当修正以保证后三年深

36、入的机制研究的进行。四、年度计划年度计划内容和目标研究内容预期目标第年1、开展人类ART主流技术及PCOS、子宫内膜异位症患者ART出生子代的生长发育、糖脂代谢和心血管结构功能的健康追综调查；收集子代脐血/外周血/组织标本，整理流行病学资料2、建立ART及生殖障碍疾病的动物模型和体外模型，研究ART技术对配子/胚胎/胎儿组织的表观遗传重编程的影响；分析出生子代及子二代的出生体重和成年后糖尿病、心血管病相关指标3、通过高通量基因芯片分析，寻找ART子代动物表达差异的基因，筛查ART导致表达异常的糖尿病、心血管相关基因1、建立并完善各类ART技术及生殖障碍患者ART子代标本库；制定出样品采集、子代健康追踪的标准化操作流程2、明确ART出生子代出现心血管、代谢异常的指标、年龄、相关表型及表观遗传修饰机制；初步评估ART与子代糖尿病、心血管病的相关性及生殖障碍疾病致胚胎源性疾病的易感性3、筛选出ART相关