发酵液的预处理和固液分离工作

1、1 发酵液的预处理和固液分离工作生物产品生产过程示意图2本门课程解决的问题生物分离过程的一般流程3预处理和固液分离内容4固液分离发酵液胞外上清液/滤液预处理提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等。不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能进行后续操作：对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去处，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。52.1 发酵液的预处理（Pretreatment ）6为何要对发酵液进行预处理？7

2、发酵液的基本特性发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动液相粘度大可压缩性为何要对发酵液进行预处理？固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大，设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。8预处理的目的 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸

3、，降低液体黏度。 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 9预处理的方法凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation 加热法 Heating调节悬浮液的PH值 Regulation of PH杂蛋白的去除 Removal of useless protein高价无机离子的去除 Removal of inorganic ion助滤剂Filter aids和反应剂 Reactant 10一 凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使

4、其聚集起来,增大体积以便固液分离。凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。11凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。12凝聚和絮凝凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构3）破坏水化膜13（一） 凝 聚 Coagulation发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周

5、围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。胶体双电层结构14胶体双电层结构15两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。胶体双电层结构不同界面上形成不同的电位:胶核表面的电位s是整个双电层的电位;Stern平面上的电位为d;滑移面上的电位为,称电位（电动电位）。16电位的计算： 17D 水的介电常数； q 胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度； 扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位d降低到其值为1/e处的距离，不能直接测

6、定.电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。 扩散层的有效厚度18式中 N一 阿伏伽德罗常数； T一 热力学温度： k 波尔兹曼常数； e 电子电荷； Zi i种反离子的化合价； Ci i种离子的摩尔浓度。双电层与凝聚由式（141）和式（14一2）可知，电位与扩散层厚度和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电荷成反比。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。19凝聚价或凝聚值 在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能脱除胶粒表面的水化膜，降低电位，使双电层的

7、排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔升），称为凝聚价或凝聚值。20SchulzeHardy法则：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、水化半径、离子运动能力的影响，次序为21Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚剂电解质有：22硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；ZnSO4；

8、MgCO3絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程机理：架桥作用采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。23（二）絮 凝 flocculation24絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。 絮 凝高分子絮凝剂的吸附架桥作用 2526可分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分

9、子聚合物1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。工业上使用的絮凝剂27 高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基） 、非离子型28聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂2）天然有机高分子絮凝剂人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题

10、，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。293）无机高分子聚合物有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。30微生物絮凝剂微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直

11、接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂 主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。3132微生物絮凝剂1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂 2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。絮凝的影响因素发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH 控制；搅拌速度。3334对于带负电

12、荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。（三） 混 凝二 预处理-加热1）加热降低液体粘度液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的有效措施。流体力学原理过速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。35加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。麦芽汁的黏度-温度曲线。二 预处理-加热2）加热使蛋白质变性凝固 变性蛋白质的溶解度小。如

13、柠檬酸发酵液加热至80以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。加热处理只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 36三 预处理-调节pH pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。37380020040060061218Filtrate Volume, cm3Time,minutesFig The effect on filtrate vol

14、ume of pH四 加入助滤剂（filter aids） 一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体 可吸附于助滤剂微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。目前生物工业中常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。39滤饼：filter cake液体通过过滤器后保留在滤器上的原液所含的固体物质;如通过净化甘蔗汁滤出的可用作肥料的杂质残渣 。40发酵液中的杂质高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）杂蛋白常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低

15、其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。五、发酵液的相对纯化 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。41（一）高价无机离子的去除方法Ca2+ 草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（注意回收草酸） ；Mg2+三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀42（二）杂蛋白的去除方法沉淀法变性法吸附法1. 杂蛋白去除-沉淀法 precipitation43A 等电点沉淀法 （isoelectric precipitation ）蛋白质的等电点大都在酸性范围内5.5)，调节发酵液的pH到蛋白质的

16、等电点是除去蛋白质的有效方法。B. 酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe 3+等。442.杂蛋白去除-变性 Denaturation 蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 2 变性柠檬酸发酵液，采用加热

17、至80以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。453.杂蛋白去除- 吸附法 adsorption加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN)52的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。46思考题1 发酵液为何需要预处理？处理方法有 哪些？2 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两 者结合使用？47第二章 发酵液的预处理和固液分离第二讲48492.2 发酵液的固液分离一 影响发酵液固液分离的因素1）发酵液中悬浮离子的大小502）发酵液的黏度viscosity ： 固液分离速度通

18、常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响发酵液固液分离的因素51收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。固液分离的目的包括两方面：52二 常见的固液分离方法过滤 filtration离心 Centrifugation 膜分离 membrane separation双水相萃取 ATPS53（一） 过 滤 filtration过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质filter medium

19、: 过滤采用的多孔物质； 滤浆filter pulp : 所处理的悬浮液； 滤液filtrate : 通过多孔通道的液体； 滤饼或滤渣 filter cake:被截留的固体物质。5455滤饼过滤：当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用适合于固体含量大于0.1%的悬浮液的过滤分离。过滤推动力：悬浮液自身压强差、重力悬浮液的外加压力过滤介质的抽真空离心力过滤阻力：介质阻力：可视为平变，且一般过滤初较明显滤饼阻力:滤饼厚度：随过滤进行而增加滤饼特性：颗粒形状、大小。大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。56过滤速度的强化1降

20、低滤饼比阻力rB 一切能够降低rB的方法：如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等。2降低滤液黏度 黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调PH、选择合适的放罐时间。3降低悬浮液中悬浮固体的浓度过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。4. 对发酵液进行预处理，改善滤液性质。572 过滤介质选择过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质：过滤介质所能截留的固体粒子大小：通常以过滤介质的孔径表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约10m，硅藻土为lm，超滤膜可小于。过滤介质的透过性

21、：是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。58过滤介质-织物介质又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是纤维的特性、编织纹法和线型。最高温度密度 (kgm3)吸水率耐磨棉尼纶涤纶9210512014515511413816-226.5-8.30.04-0.08良优优滤 液澄清度阻力滤饼中含 水滤饼脱落寿命堵孔倾向平纹斜纹缎纹依次降依次降依次减依次易中长短依次易59过滤介质-粒状介质有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质：一般不与酸

22、碱反应，化学性能稳定；形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作压力变化。硅藻土过滤介质通常有三种用法：（1）作为深层过滤介质。硅藻土过滤层具有曲折的毛细孔道，借筛分、吸附和深层效应作用除去悬浮液中的固体粒子，截留效果可达到1m。（2）作为预涂层。在支持介质的表面上预先形成一层较薄的硅藻土预涂层，用以保护支持介质的毛细孔道不被滤饼层中的固体粒子堵塞。（3）用作助滤剂。60过滤介质-多孔固体介质 如多孔陶瓷、多孔玻璃珠、多孔塑料等，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。 6162典型过滤设备：按操作方式分类：间歇过滤机、

23、连续过滤机按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作） 转筒真空过滤机（连续操作） 过滤式离心机固液分离过滤设备1）实验室用抽滤装置632）板框压滤机plate and frame filter 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。64广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 板框压滤机65包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。

24、自动板框式压滤机自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。66673）真空转鼓过滤机（rotary-drum vacuum filter）真空过滤设备以大气与真空之间的压力差作为过滤操作的推动力。生物工业中，用得较多的是转筒式真空过滤机和带式真空过滤机。转筒真空过滤机的结构转筒真空过滤机是一种连续操作的过滤设备，设备的主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒，表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿径向被筋板分隔成若干个空间。转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约900-1300，圆筒缓慢旋转时(转

25、速约min)，筒内每一空间相继与分配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区，卸渣及再生区3个区域。 6869结构：转鼓滤饼滤布滤网离心过滤机工作原理图转鼓(上有小孔，亦称悬框)； 滤网； 滤布； 机架。 原理： 由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。4）离心过滤机（centrifugal filter）5）硅藻土过滤机 diatomite filter硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它

26、是一种预涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的一般工艺过程。在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。目前，国内主要用于酒类和饮料过滤 70硅藻71（二）离心分离对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。7273优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。 通常

27、情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。离心分离74按速度和离心力：1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 1104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机 转速2.5-8104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。离心机的种类与用途对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。 按离心机的作用方式：斜角式平抛式管式蝶式螺旋式多室75离心机的种类与用途761）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；角度越大，沉降越结实，分离效