12《仪器分析》高效液相色谱法(3课时)

1、章节名称第三篇、色谱分离技术授课安排授课时数3授课时间授课方法讲授授课教具教学目的1、了解高效液相色谱法特点2、了解高效液相色谱仪教学重点高效液相色谱法特点教学难点高效液相色谱仪项目十九现代高效液相色谱仪的认知一、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着流动相流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细

2、小（10um）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的流动相流速，使用了高压；输液泵，使流速达到110mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以来逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。与气相色谱相比高效液相色谱具有如下特点：1分析范围广气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20%。对于占有机物总数近80%的那些高沸点、热稳定性

3、差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。2.可选择的流动相多气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而咼效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。3操作温度低气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法

4、已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。二、高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统（图1210）。L-I图1210高效液相色谱流程示意图（一）高压输液系统高压输液系统的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。高压输液系统由贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置组成，其核心部件是高压泵，要求高压泵应具有输出压力高，输出流量恒定，流量设定范围可调。梯度洗脱装置的作用是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质

5、溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分离时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。（二）进样系统在高效液相色谱中，一般采用旋转式六通阀于高压下进样。其优点是进样量可变范围大，耐高压，宜于自动化，但易造成色谱峰柱前扩展。（三）分离系统液相色谱柱一般采用内壁抛光的不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高，柱长都比较短，一般在530cm，柱径为45mm。柱子的填充取决于柱填料的性能，对于生物胶或离子交换树脂等，因遇到溶剂会膨胀，所以必须采用匀浆湿法填充。（四）检测记录系统高效液相色谱检测器要求具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积

6、小等特点，且对温度和流量变化不敏感。但至今还没有一种像气相色谱那样高灵敏度的通用型检测器。因此应当根据试样的性能来选用相适宜的检测器。目前，液相色谱常用检测器有紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光检测器和电化学检测器等。1紫外光度检测器（UV）其作用原理是依据被分析组份对特定紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系服从比尔定律。紫外光度检测器具有较高的灵敏度，最小检测限可达10-9go对温度和流量不敏感，可用于梯度洗脱，几乎所有的高效液相色谱都配有紫外光度检测器。图1211是一种双光路结构的紫外光度检测器光路图。图1211紫外光度检测器光路图s低压汞灯，F1；F2滤光片，L1,L2,L3,L

7、4透镜q测量池，C2参比池，。丄巴一光电管2示差折光检测器（RI）依据不同性质的溶液对光具有不同的折射率，通过连续测量溶液折射率的变化，便可知各组分的含量。溶液的折射率等于纯溶剂（流动相）和溶质（试样组分）的折射率乘以各自的质量分数之和。示差折光检测器为通用型检测器，凡与流动相折射率不同的组分均可进行检测，且操作简便。但这种检测器灵敏度较低，对温度敏感，不能作梯度洗脱。3荧光检测器根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极咼的荧光检测器。它的最小检出量可达10一12g.mL-1，由于不同物质的激发波长不同，受激后所产生的荧光波长各异，因此荧光检测器具有很高的选择性。它适合于稠环

8、芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。4电化学检测器电化学检测器是一薄层电解池。具有电化学氧化还原性质的化合物流进检测器即发生电解，产生的电流经放大而被检测。它适用于有电活性的硝基、氨基等还原基团的有机化合物的检测。检出限达皮克数量级10-12g。三、高效液相色谱的类型根据固定相和分离机理的不同，高效液相色谱可以分为以下几类。（）液一固吸附色谱液一固吸附色谱是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。当流动相携带试样组分通过吸附剂时，组分分子和流动相分子对吸附剂表面的活性中心发生竞争吸附。与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附剂表面活性中心的几何结构

9、相适应的组分也易于吸附，呈现较高的保留值。液一固色谱中的固体吸附剂主要有极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性碳等。液一固吸附色谱宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适宜于分离异构体，但由于对相对分子质量的选择性较小，故不宜于分离同系物。（二）液一液分配色谱液一液分配色谱法中常用硅胶作为载体，在其表面涂渍一薄层固定液作为固定相，被分离组分随流动相进入色谱柱在两相间经过反复多次分配，各组分间产生差速迁移，从而实现分配。液一液分配色谱常用的固定液有，一氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液一液色谱流动相尽可能不与固定液互溶，两者的极性差别应很大。固定液为极性、流动相为非极性的液一液色谱

10、称为正相色谱，反之称为反相色谱。前者主要用来分离极性化合物，被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱；后者主要用来分离非极性化合物，被分离组分流出顺序与前者正好相反。液一液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。但由于固定液易流失,使色谱柱的保留行为发生改变，并引起分离试样的污染，因此已基本上被化学键合固定相所取代。（三）化学键合相色谱化学键合相色谱是通过共价键将有机固定液结合到硅胶载体表面，而得到各种性能的固定相，特别是非极性键合相材料的商品化，极大地促进了“反相”高效液相色谱的发展。键合相的烷基链长和键含量是影响固定相试样容量、溶质k值、柱效能和分离选择性等色谱性

11、能的重要因素。目前应用最多的是十八烷基键合硅胶（Octadecylsilane），通常称为ODS固定相。化学键合相色谱的最大特点是可以通过改变流动相的组成和种类来有效地分离极性、非极性和离子型化合物，所用键合固定相不易流失，适用于梯度洗脱。但使用时应注意键合固定相不适于酸、碱度或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相体系。（四）离子交换色谱离子交换色谱是根据离子交换树脂上可电离的离子与流动相中带相同电荷的组分离子进行可逆交换，这些离子对交换树脂具有不同的亲和力而彼此分离。离子交换色谱适于分析在溶剂中能形成离子的组分，不仅广泛用于无机离子的分离，亦可用于有机物和生物物质，如蛋白质、氨基酸、核酸等的分离。（

12、五）离子色谱离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。这种方法用离子交换树脂作为固定相，电解质溶液为流动相，用电导检测器检测。为了消除流动相中强电解质背景离子的干扰，设置了化学抑制柱。例如在阴离子分析中，当待测阴离子从色谱柱洗出进入电导检测器时，若其电导值与流动相的电导值相比差异较大，则引起电导的明显改变而被检测。但如果流动相电导值比较高，因待测离子进入流动相而引起的电导改变量则非常小，即检测器对待测离子的灵敏度很低。通过化学抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，消除了本底电流的影响，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。至今离子色谱是分离分析常见无机混合离子

13、（NO-、NO-、SO2一、PO3-）唯3244一快速、灵敏、准确的分析方法，随着电化学检测器、紫外光度检测器的应用，可分析的离子增多，从无机和有机离子到金属离子，从有机阳离子到氨基酸、糖类等均可用离子色谱进行分离分析。（六）凝胶色谱凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子随流动相沿凝胶颗粒外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积大的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地