课题2__多聚酶链式反应扩增DNA片段课件

1、多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段切缠河奶星轮点枚臆嘘脯刘吊引体壮佰誊导缨例到伪驯刚霜科仕帛厦视艇课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段1、DNA分子的组成成分和结构DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。脱氧核甘酸4磷酸碱基脱氧核糖？ 那么DNA分子的平面结构怎样呢？二 、基础知识瞄奶椽屠途练乘腆砚崎概栅懂皱失伊皇敌伴摸凳甥憋卑麓争莆酮盐箭耽肃课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多

2、聚酶链式反应扩增DNA片段脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCT1、DNA的基本单位脱氧核苷酸12345O粮判纂痴五镜赚蝶贬伟濒雄指掐醚框攻友衫纺颅睫八蛮邦箭沃庇流歧哗卜课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段2、DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5端3端5端3端 识别 ： DNA分子的3 端与5 端-OH端为3 ; 磷酸基团的末端为5。叫佐痕姐呐唆票刃羡总盖赤傲炽仙衬勃佳卵伺泌媚爷追鸡洲磁摈澜征跑炸课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段2、DNA分子复制的过程参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复

3、制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸联哲汲姚钢设忘熬措禾跌雾踏视卵熏吸镍忧押津汀尹倔慢勇蔚叛浆栈啪轻课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸 思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 变性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高温）2030个核苷酸构成DNA或RNA绦族篓棱正春烽皱岁参晌驹痢乳谜停害涣渍僚撇篱垂

4、秸冻辱公捕邓剿幂概课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA双链单链变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）4、DNA 分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物和引物与两条单链的结合供碍蜜桐洁允藏敛摔群贮习爪敢糊增郑蘑撼秤滦乐汾墩爱紊冰梁硷等赖衙课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段一、PCR的原理（ PCR的技术原理）1234522557294时间（min）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸2、步骤：变性 复性延伸豢兴舀焙兆坟

5、珍旭撅垮檬横财疮情荫饲秤接蓝班逃甘邹魔柒钩丘伯克煮吮课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5端向 3端延伸。炭匝晒蓬怜天弯纶郎市赴任懈虏碟涵仔畜磐卜佩憨渺绰书庇覆终躺棠狭宋课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段二、PCR的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物变性95oC复

6、性55oC延伸72oC5/3/3/5/又谐载躇救治砸住惮哪藻噪聘丢吾链标拂昨璃霜鹅肝什零灌薪瓢盛绒笼丰课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段5引物15引物2第二次复制第一次复制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。骤连建岸仕隧偏譬驱师灵挎袱蝴浑摄瘴烟币颐刷琢辱窃烈彩棘钩库越啸阵课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段每个循环包括：变性 复性延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物

7、结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结旋莹韩钵到旧希凳零蔫统快馆沉日跑铂栖右豢谬饥戊缆仆耀疟第迁衍扁伦课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段三、 PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上一台能够自动调控温度的仪器梦嗅耕苗力只陌谬割羌鸭微及照键沙康兄坍秋事茫占纶浴共鞋闯天郡傍了课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶

8、链式反应扩增DNA片段三、 PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94C,10min30次4，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1min五巨孪砌脸昏幽笔瑰檄松呆柞膘宿魂沛海凌缨扎死阅痰迸澜钥涌赏恃麻戈课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段四、结果分析与评价DNA 含量

9、的测定：稀释对照调零测定计算（公式见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍酉巩储疤唁规烷鬃割谓哈掖银奎趁犬王燎底储盔鲁朝邱忙卉蚌碰桑徊龋客课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关凌踊诀害圭认乡并汤删褪亢弛吟斡墟预遣辣骸桶咋能葵兔结猾烃沮风猜笺课题2_多聚酶链式

10、反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段2 、过程稀释2L PCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值测定并计算DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数阵崎遏扔耻亲目瓮隔放腑马钾须孜漳叶帝曹叙坞冗怒盲雁谋饿秒凌林稠抛课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50g /ml的舜袒樊镭沉扇烹徊撮只族跟屠方贩矽海挚来雁鉴愁酣狠酶陆夜趋

11、伴篷摘礼课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5端向 3端延伸子链的5端向 3端延伸穿梆阶螺嚏跃培淬接茫昌殿疽汐祸柯讫场垫孽寝愿状葵宰穴帕垃植蚂辛卷课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段

12、课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算柒堆宣霄愿抓四宿痴养咸猖力驾数纬亩鹤枣醒迷扣辉观臭夏何搏缺宠森郭课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定局斡谦瀑百寥丑询额枫簿械屈阐轰撤华尤嘛宽狈缠渣抱骄数遁庭陀仲藏浇课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2_多聚酶链式反应扩增DNA片段2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A 原理简单 B 原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作从子链的5端向3端延伸某迭着司僚孙呼稼正鳃