培养基配制及灭菌课件

1、植物组织培养第一节培养基的配置一、定 义人工配制的微生物或动植物细胞生长繁殖或积累代谢产物营养基质二、培养基的组成成份无机成分： 大量元素：氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、钠、镁、硫 微量元素：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯有机成分 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。植物生长调节物质： 生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：6-BA, KT，TDZ，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333琼脂、明胶、硅胶等水I.大量元素（mg/L） NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl22H2O 440 MgSO4 . 7H2O 370

2、常用的MS培养基配方：II.微量元素（mg/L） MnSO4 4H2O 22.3 ZnSO4 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KCI 0.83 Na2MoO4 2H2O 0.25 CuSO4 5H2O 0.025 III.磷盐 KH2PO4 170 IV. 铁盐 Na2 EDTA 37.5 Fe SO4 7H2O 27.8V.有机（mg/L） 甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素 B1 0.1 盐酸吡哆醇 B6 0.5 烟酸 0.5 肌醇 100 附加成分 ( g/L ) 蔗糖 30 琼脂 8.0 PH = 5.86.21、母液的配制（储备液的配制）2、培养基的配制三、培养基的配制MS培养基组成成

3、份1升储备液用量（mg）每升培养基取用量（mL）20储备液1（大量元素） NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4330003800088007400340050200储备液2（微量元素） KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O1661240446017205055 5200*储备液3（铁盐） FeSO4.7H2O Na2.EDTA.2H2O55607460 5200*储备液4（有机成分） 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸2000010010020400

4、 51、储备液配制一般母液浓度是实验需要浓度的10-200倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。把几种药品配在同一母液中时，要注意各种化合物的组合以及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、钡离子与硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。铁盐必须单独配制。将FeSO4.7H2O水溶液缓慢加入到Na2.EDTA.2H2O微沸水溶液中，并不断搅拌，最后定容。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时按比例稀释。注意事项激素溶解方法 IAA、IBA、GA 溶于少量的95的酒精 加水定容； NAA 热水或少量95的酒精 加水定容； 2，4-D

5、少量95%的酒精和1M的NaOH溶解 加水定容； KT和BA 溶于少量1M的HCI 加水定容； 玉米素 溶于少量95的酒精 加热水定容。2、培养基的制备取母液调pH值培养基熬制灭菌称取蔗糖、琼脂扎口加适量水分 装定 容接种确定配方其他物质定容1）将培养液倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。注意：火不要太大，防沸出。2）用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。3）取出培养基，并初步定容。培养基熬制及初步定容调pH值及分装1）用1M NaOH或HCl调pH值为5.8。2）趁热分装，装瓶量一般为瓶容量的1/31/2；装试管一般为试管高度的1/51/4。3）避免琼脂粘在管口

6、或瓶口上，最好用漏斗。本实验中，请借助玻璃棒引流。要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。扎口本实验中先套封口膜，用橡皮筋扎好，然后再套上牛皮纸，用橡皮筋扎好。培养基用湿热灭菌1）首先取出灭菌桶，向锅内加入适量的水。2）放回灭菌桶，装入待灭菌物品。3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。4）水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。5）当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121，20分钟灭菌。6）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子。7）将取出的灭

7、菌培养基放入37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器的体积/mL在121灭菌所需最少时间/min20-501575-15020250-50025100030本节课任务1、器皿消毒（1人/组）每组包2对培养皿，其中1个培养皿装3张滤纸；包扎2个100mL烧杯，2个250mL三角瓶，每瓶装100mL蒸馏水包扎刀柄，弯嘴镊子；写上各组标记；交给陈老师，统一灭菌。MS基本培养基的配制 大量元素 30.0mL 微量元素 3.0mL 铁盐 3.0mL 有机 3.0mL 电磁炉加热煮沸融化琼脂后，加水定容至582mL（用量筒）。加不同激素浓度(0.5、1、2mg/L)MS培养基的配制 取200mL烧杯3个，分别吸取0.1mg/mL 2,4-D溶液 烧杯1: 2,4-D溶液1mL+MS基本培养基194mL 烧杯2: 2,4-D溶液2mL+MS基本培养基194mL 搅拌混匀 烧杯3: 2,4-D溶液4mL+MS基本培养基194mL 用NaOH调pH至5.8,再加水定容至200mL(用量筒)。分装：50mL三角瓶，约20-30mL/瓶，盖上封口膜，用牛皮纸包扎。灭菌：标上激素浓度和姓名，统一放置灭菌。保存：灭菌后，每组带托盘取培养基，放于316培