医学微生物学课件：第七章 病毒的诊断防治和朊粒

1、Review for last lessonViral transmission routes Key factors in interaction between viruses and hostInfection types of viral infectionsAnti-viral immunityInterferon (definition, types, roles and mechanism for the anti-virus activity )Anti-viral immunityInnate immunity (INF & NK cells)Specific immune

2、response humoral immune response (特异性抗体：中和及非中和抗体) Cellular immune response （CD4+ & CD8+ ）实验室诊断Laboratory Diagnosis of Microbial Infections Detection of viral Infection （病毒的检测方法） Before Proceed Diagnosis Symptoms（临床症状）Travel history （旅行史）Season of the year （季节）A presumptive diagnosis （可能诊断）一、标本的采集与送检

3、1. 时间：急性期标本2.部位：根据不同病毒的感染选择部位3.标本处理：加抗生素抑菌； 冷藏； 双份血清的采集 4. 送检时间：尽快送检 二、病毒的分离培养与鉴定分离培养： 细胞培养：最常用的基本方法 动物接种：比较原始的方法，目前应用较少。 鸡胚培养：用于流感病毒的分离。鉴定： 方法： 形态学； 特异抗体染色； 病毒滴度的测定； 分子生物学方法。 内容： 病毒种类与型别； 病毒的毒力。（一）病毒的培养 Animals(动物)primary isolation of certain virusesStudies of the pathogenesis of viral diseasesStud

4、ies of viral oncogenesis成瘤性 Fertile eggs(鸡胚)Cell cultures （细胞培养）1. Cell culturePrimary cell cultures（原代细胞）Diploid cell lines (二倍体，up to 50 passages)Continuous cell lines（传代细胞株）Detection of virus-infected cellsDevelopment of CPECell lysis or necrosisInclusion body formationGiant cell formation原代培养原代培

5、养 Primary Cell CultureSensitive to a wide range of viruses myxovirus, enterovirus, adenovirusRoutine for fresh isolatesOnly passage for a few timesDiagnosis & vaccine preparation二倍体细胞 Diploid Cell CultureGrow a large but finite passages(有限传代)Have normal chromosome numberDiagnosis & vaccine preparati

6、onHuman fetal lung fibroblast （HFLF）and MRC5 for HCMV传代培养Continuous Cell CultureDerived from tumor tissue (hela) or by transformation of a primary cell (BHK, Vero)Only for researchBe very convenient CO2 incubatorCell cultureC6/36 cellsIFA: dengue viral antigensCPE after DV infection 2. Inoculation i

7、n fertile eggs (embryonated eggs)To be used for isolation of influenza virusesFertile eggs (embryonated eggs)绒毛尿囊膜尿囊腔卵黄囊腔羊膜腔Allantoic Cavity Inoculation （尿囊腔接种）influenza inoculuminoculation in allantoic cavity （尿囊腔）epithelial cellsharvest2 days37detection9-11days-old eggCulture with chicken eggsInoc

8、ulation ProcesscheckinjectdrillHarvest From Allantoic Cavity （尿囊腔收获） 3. Animal inoculation * 不同的病毒易感动物不同，且目前对于大多数病毒来说，理想的实验动物模型非常有限。* 易感动物：* 感染动物模型： * 疾病动物模型： 能自然或人工感染， 可发病或不发病能自然或人工感染，可发病甚至致死，不表现人类疾病特定的症状和体征 能自然或人工感染，可发病甚至致死，与人类疾病症状和体征相同（似）动物脑内接种接种DEN-1/GZ2002株10天后的乳鼠发病情况。 小结：培养特性及实验动物 * 细胞培养： 原代、二

9、倍体、传代等敏感细胞 培养时间长，不出现CPE，需用免疫学方法证实 * 鸡胚： 主要用于流感病毒等 * 动物：小白鼠乳鼠等1. 形态学检查 光学显微镜：病毒抗原；特异性病变电子显微镜：免疫电鏡；普通电鏡（二） 病毒的鉴定方法： 形态学； 特异抗体染色； 病毒滴度的测定； 分子生物学方法。内容： 病毒种类与型别； 病毒的毒力。Microscopy1. EM /IEM2. LM: virus-infected cells Cell lysis or necrosis Inclusion bodyGiant cells 病毒抗原特异性病变 质粒prM-E转染EAHy926 细胞48h后整合素3表达变

10、化prM-E蛋白整合素3合成图 病毒感染 24hr （免疫荧光双染色）GHHBV2. 感染数量和毒力的检测毒力检测： plague assay（空斑实验） 大小及形态 Animal experiments：LD50 50% tissue cultuer infectious dose （TCID50） Multiplicity of infection (MOI)： （viruses/cell）PLAQUE ASSAYTiter Virulence Test of plaque formation(空斑形成试验)Dilute virusmonolayer of cellcover agar 3

11、7，35d plaque （空斑 ）To measure virus quantity PFU-plaque formation unit/mlVero细胞单层培养噬斑记数法(plaque assay)，测定DEN病毒的滴度。A孔为空白对照；B孔为DEN-2/Tr1751株感染组C，D孔为DEN-1/GZ2002株感染组，三、快速诊断（rapid diagnosis）（1） 抗原检测：实用而快速（ELISA/WT）（2）病毒核酸的检测：PCR （3）血清学检测： IgM， IgG Double sera samplesAcute phase and Convalescence phase An

12、tibody titer 4 timesIgM: early diagnosisMolecular diagnostics 1. PCR2. Nucleic acid hybridizationDot blotSouthernblotNorthernblotBlot in situ核酸点膜杂交显影/显色DNA 酶切电泳转膜杂交显影/显色RNA 变性电泳转膜杂交显影/显色细胞/组织切片暴露核酸杂交显影/显色原理3. 血清学：检测抗体 by ELISAELISA 4. Detection of viral antigensELISAWestern BlotIF (免疫荧光染色)direct：Ag?

13、-Ab*indirect：Ag?-Ab-抗Ab*Western Blot （蛋白印记技术，免疫印记技术）小结：Common WaysA.Gold StandardCollect specimensViral isolation (培养)EM (形态)Viral detection（IFA）Serologic assay （IgM & IgG）B. Rapid DiagnosisDetect viral proteins （ELISA & WB：Ag）Detect viral DNA/RNA （PCR）小结：病毒感染的实验室诊断标本的收集和运输病毒的培养：细胞培养（原代、二倍体及传代细胞），鸡胚

14、培养，动物接种。病毒的鉴定（方法和目的）： 形态学观察（EM/LM）: 细胞特异病变及病毒形态； 病毒组分的检测：ELISA；PCR；WT；IFA； 血清学检测：IgM & IgG； 病毒的毒力：plague assay；LD50（TCID50）四、其他检测方法 Hemagglutination testHemagglutination inhibition testHemadsorption(红细胞吸附)Viral interferenceNeutralization TestV-HARBC (vertebrate)hemagglutinationcellAbhemadsorptionhem

15、agglutination inhibitionHemagglutination testHemagglutination inhibition test, HIprincipleV-HA + RBC hemagglutination(V-HA + Ab?) + RBC HINeutralization test (中和试验)V Cell CPE(+)V+Ab Cell CPE(-) Hemadsorption(红细胞吸附)Adsorption of erythrocytes（红血球） to infected cellsDue to the presence of virus-encoded

16、hemagglutinin (parainfluenza, influenza) in cellular membranesCell本章小结 标本采集和运输的注意事项诊断项目和方法 病原学的诊断：病原体的分离和鉴定 （培养、形态观察、CPE） 病原体成分的检查：Ag （ELISA，IFA） 核酸 （PCR） 血清学检测：IgM、IgG 思考题病毒分离培养的方法有哪些？病毒在细胞内增殖的指标有哪些？病毒的实验室检测方法有哪些？每种方法的检测内容是什么？ 病毒基因检测主要方法有哪些？标本的采集和运输有哪些注意事项？Review for last lesson标本的采集与运输 病毒感染的实验室检测流

17、程病毒分离的方法有哪些？何谓CPE？病毒的鉴定包括哪些内容？Prevention of Microbial Infections第一节 免疫预防预防原则Isolation of infection source （隔离传染源）Cutting off transmission route （切断传播途径）Vaccination （预防接种）Specific immunityNature immunity（自然免疫）Active immunity: infectionPassive immunity: Ab from motherArtificial immunization（人工免疫）Activ

18、e : vaccinePassive : antitoxin（抗毒素） Ig （免疫球蛋白）Artificial active immunity is induced by giving vaccines and toxoid to provide long-term protection.Artificial passive immunity is induced by giving immune globulins to provide immediate protection.Artificial immunizationArtificial active immunizationArt

19、ificial passive immunizationMaterialsAg (vaccine, toxiod)Ab, CK, CellsAppearanceSlow (24w)Fast (immediate)MaintenanceLong (months y)Short (23w)UsePreventionTreatmentUrgent treatmentVaccinesAntigens from infectious agentsVaccines 1796 Jenner: 牛痘预防天花 1800s Pasteur（巴斯德）: Attenuated virus （狂犬病疫苗） 1996 :

20、 DNA vaccinesVaccines Attenuated live vaccine Inactivated vaccineSubunit vaccine（亚单位疫苗）Gene engineered vaccine (基因工程疫苗)Nnucleic acid vaccine (核酸疫苗) Chimeric vaccnie (嵌合疫苗)VaccinesAttenuated live vaccine (减毒活疫苗) * 经毒力变异或人工选择培养（在非自然宿主细胞中经若干传代培养）将有毒株变为减毒株或无毒株。 * 模拟自然感染，诱发较强的免疫应答 * 安全性（返祖）；生产成本高；冷藏 BCG；

21、Sabin Vaccine （Poliovirus）VaccinesInactivated vaccine （灭活疫苗）Physical or chemical methods（将具有毒力的病毒通过物理或化学方法灭活后制成疫苗） 安全、稳定； 便于运输； 用量大，需加强免疫； 生产成本较高。Cholera(霍乱) 、Typhoid(伤寒) vaccineEncephalitis（脑炎） B vaccineSmallpox Vaccination Jenner 1796 : Cowpox/Swinepox 1800s Compulsory childhood vaccination（义务接种）

22、1930s Last natural UK case 1940s last natural US case 1958 WHO program October 1977: Last case (Somalia，索马里)Smallpox No animal reservoir Lifelong immunity Subclinical cases rareInfectivity does not precede overt symptoms One Variola serotype Effective vaccine Major commitment by governmentsReported

23、cases per 100000 population1001010.10.0010.0119501960197019801990Inactivated (Salk) vaccineOral vaccineCases per 100,000 population United StatesDifferenceAttenuatedKilled Routenature/injectioninjectionQuantitysmallmuchTimesfewtime after timeMaintenance35y0.51yHumoral IgG、IgAIgGCellularbetternot goo

24、dPreservation4,weeks4,1yVaccinesSubunit vaccine（亚单位疫苗） * 用化学试剂裂解病毒，除去核酸，提取包膜和衣壳蛋白亚单位制成的疫苗。 * 纯度好，副作用小；成本较高。Polysaccharide vaccine（多糖疫苗）pneumococcal polysaccharide 肺炎球菌多糖附： 流感病毒裂解疫苗：全病毒蛋白VaccinesGene engineered vaccine (基因工程疫苗) 利用DNA技术，将病毒结构蛋白或诱导保护性免疫应答的基因导入细菌、酵母或哺乳动物细胞等中表达，表达产物经提取纯化制成疫苗。如HBV疫苗。HBV v

25、accine Recombinant DNA Single gene (subunit)提取 RNAdsDNA（S gene）Express plasmidS-antigen mRNA proteinHepatitis B vaccineraised in yeastRT-PCRGene engineered vectored vaccine（基因工程载体疫苗）vectors：BCG , vaccinia virus (痘苗v.)to insert the gene into the genome of an avirulent virus attenuated vaccines载体疫苗DNA

26、 Vaccines：外源抗原基因克隆到真核质粒表达载体上，注射至动物体内使其在活体内表达，产生的抗原刺激机体产生免疫应答反应。Nucleic acid vaccine (DNA 疫苗) plasmidGene for Ag Muscle cellMuscle cell expresses protein - antibody made by CTL response 嵌合疫苗Dengue viruse 以黄热病毒（yellow fever virus， YFV）疫苗17D 的cDNA克隆为骨架，利用dengue 的结构蛋白 prM/E置换YFV的相应基因。 临床III 期 重组疫苗流感疫苗轮状

27、病毒PB2PB1PAHANANPMNSPB2PB1PAHANANPMNSPB2PB1PAHANANPMNSAttenuated Donor Master StrainNew Virulent Antigenic Variant StrainXAttenuated Vaccine Strain: Coat of Virulent strain with Virulence Characteristics of Attenuated StrainVirulent strainVaccinesChemically synthesized peptide （合成肽疫苗） malaria（疟疾）Poor immunogenicity脊髓灰质炎疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞、Vero细胞）麻疹疫苗 减毒活疫苗（鸡胚细胞）流行性腮腺炎疫苗 减毒活疫苗（鸡胚细胞）风疹疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞）甲型肝炎疫苗 减毒活疫苗（人二倍体细胞）人用狂犬病疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）乙型脑炎疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）森林脑炎疫苗 灭活疫苗（地鼠肾细胞）乙型肝炎疫苗 基因工程疫苗（酵母菌表达）疫苗名称 疫苗种类（培养细胞种类） 我国常见的病毒疫苗小结： Artificial active immunization Artificia