人源抗肿瘤坏死因子噬菌体抗体的基因结构分析

1、人源抗肿瘤坏死因子_ 噬菌体抗体的基因结构分析a人源抗月中瘤坏死因子0噬菌体抗体的基因结构分析袁 斌 何 君 俞晓峰 王 慧 刘怀田 周育森 黄 策() 军事医学科学院微生物流行病研究所北京 100071a摘要 从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人TNF的人源单克隆抗体，并对筛选到的抗体基因a进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的4个特异性抗TNF噬菌体抗体克隆的重链基因序列 相同 , 该重链基因长681 bp , 编码 227 个氨基酸残基属于人免疫球蛋白第 ? 家族 , 其中 1,119 位氨() ( ) 基酸残基为重链可变区VH,120,227 位为重链恒定区 1 CH1 。 4 个噬菌

2、体抗体克隆的轻链均缺失 , 因此实际上筛选到的是单重链抗体 。对重链基因编码的重链蛋白的特性进行了分析。关键词 肿瘤坏死因子; 噬菌体显示; 单克隆抗体; 重链 ; 测序a The gene sequencing and analysis of anti 0TNFhuman monoclonal antibodiesYuan Bin , He J un , Yu Xiaofeng , Wang Hui , Liu Huaitian , ZhouYushen , Huang Ce( )Institute of Microbiology and Epidemiology , Academy of

3、MilitaryMedical Sciences , Beijing 100071a Abstract Human anti OTNFmonoclonal antibodies were selected from pooled human antibody combinatorial libraries using phage display technology , and their genes were sequenced and analyzed. The results showeda that the genes encoding heavy chains of the four

4、anti OTNFantibodies were the same , which comprised 681 nu2 cleotidesand encoded a protein of 217 amino acids , belonging to human IgG ? genefamily , wherein 10119() amino acids constituted the V region of the heavy chain VHand1200 227 amino acids constituted the C1 re2( ) gion of the heavy chain CH

5、1. All of the four antibodies lacked the light chain , showing that they were all the same mono heavy chain antibody. The characteristics of heavy chain protein encoded by the heavy chain gene were also analyzed.Key words tumor necrosis factor ; phage display ; monoclonalantibody ; heavy chain ; seq

6、uencing1 抗体库技术自 1989 年问世以来, 发展很快 ,HIV 、 HAV 、 HBV 噬菌体抗体库由王海涛教授赠送。它与传统的杂交瘤技术相比，具有制作周期短、操作 菌株XL10Blue、质粒 p TNF 、 pComb3、 pBluescript 简便 、成本低等优点 , 特别是该技术可以不经免疫而 及辅助噬菌体VCSM13均为本实验室保存。直接制备人源抗体，这对于制备针对于人自身抗原1 . 2 主要试剂a( a)组分如月中瘤坏死因子 OTNF来说 , 具有其他抗体各种限制性内切酶均购自 Promega 公司 , 兔抗 制备方法不可比拟的优势。我们利用这种技术从混a合的噬菌体抗体

7、库中直接筛选到了抗 TNF的人源a M13 IgGOHRP由毛春 生博士赠送。重组人TNF按2 抗体 , 并对抗体的重链和轻链基因进行了克隆和测 文献从 p TNF 菌株中提 取和纯化。 序 。 1 . 3 混合噬菌体抗体库的制备分别取HIV、HAV、HBV噬菌体抗体库保存液各以101 ,分别按文献3的方法制备噬菌体抗体。用( PBS 缓 冲 液 50 mmol/ L 磷 酸 缓 冲 液 , p H 7 . 2、 1 % 1 材料和方法) BSA 、 150 mmol/ L NaCl 将 3 种噬菌体抗体库适量稀12释为10cpu ,并等量混合,冻存于070 ?。1 .1噬菌体抗体库、菌株及质

8、粒)al .4 噬菌体抗体的筛选及鉴定，说明它们是人重组TNF的特异性抗体。文发表民以纯化的人重组TNF为固相抗原按文献3的2.2 重链轻链基因的序列测定a方法用混合的噬菌体抗体库进行 5轮筛选，筛选到 选取4个特异性抗TNF噬菌体抗体克隆，分别 的阳性克隆按文献4的方法进行鉴定。克隆其重链和轻链基因 , 并进行两端测序 , 结果发现 ,4 个克隆的重链基因序列完全一致, 将两端序列 1 . 5 噬菌体抗体克隆质粒 DNA 的提取与纯化用经过鉴定的噬菌体感染 XL10Blue后铺板，过测定的结果合并后得到图1的基因序列 。 4 个克隆 夜培养后挑取单菌 落 接 种 于 含 50 mg/ L 羧

9、 苄 青霉 的轻链基因序列不一致, 序列分析表明这4 个基因( ) 素 、 10 mg/ L 四 环 素 的 LB 培 养 基 中 培 养 过 夜 , 用 均不能编码完整的多肽链测序结果略, 因此 , 这 4 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质粒 。 个噬菌体抗体克隆的轻链实际上是缺失。2 . 3 重链基因结构分析 1 . 6 重链 、轻链基因的克隆将提 取 和 纯 化 的 质 粒 分 别 用 Spe I/ Xho I 和 对图 1 的重链基因序列进行分析表明 , 重链基 S al I/ Xba I 双酶切 , 用低熔点胶法回收约 660bp 大 因长 度 为 681 bp , 编

10、 码 227 个 氨 基 酸 残 基 , 经 与 小的 DNA 片 段 , 并 与 用 相 同 酶 切 的 pBluescript KS GeneBank的已知序列对照分析,它与已知的几种人+ （?连接,转化XL10 Blue后,在含XOgal、IPTG的LB IgG ? 家族的重链基因恒定区同源性高达98 % 检索） 平板上挑取白色转化子, 并用 PCR 和酶切方法鉴定结果略 , 因此我们获得的抗体重链基因片段属于IgG 第 ? 家族 。对照已知的抗体序列 , 我们发现该插入了重链和轻链基因片段的转化子。1 . 7 重链和轻链基因序列的测定重链基因的第 1,119 位的氨基酸残基为抗体重链将

11、带有重链轻链插入基因的转化子接种于含的可变区 ,120,227 位氨基酸残基为抗体重链的恒50 mg/ L 羧苄青霉素 、 10 mg/ L 四环素的 LB 培养基 定区 。我们在检索中没有发现与该抗体重链可变区 中培养过夜, 用 Promega A7100 试剂盒提取和纯化质部分有高同源性的已知基因 , 因此该重链基因片段粒 。在 Beckman 373A 型 DNA 自动测序仪上从两端 为新发现的抗体重链基 因。2 . 4 抗体重链基因编码的重链蛋白的特性分析进行DNA 序列测定 。我们在计算机上用 ProtParam Tool 预测了重链基因编码的蛋白质的特性, 结果表明 , 重链基因编

12、码2 结果的蛋白含 227 个氨基酸残基, 其中带负电荷的氨基酸残基有12个，带正电荷的氨基酸残基有20个，各2.1阳性克隆的筛选及鉴定氨基酸的含量和占总蛋白的百分比如表 1所示。其 从最后一次淘筛洗脱下 来的噬菌体克隆中随机相对分子质量为2395.8 ,理论等电点为9.28。该蛋 选取64个克隆,制备噬菌体抗体进行鉴定，有61个a白在哺乳动物细胞、酵母和大肠杆菌中的理论半衰 克隆能与TNF结合，通过其他多种方法确定其中7a （期分别为5.5h 、3min和2min 。个克隆对TNF具有高亲和性和特异 性结合能力另不*EirB cAST f.j-JH !1i!ln w1 .勺4=itUI.w.

13、 t L11.T. flrX- 4Xi亡 5TV：T父 trF* &.1青*用H-l对.4wui5 J ：4KJ 1rAE 1 ra口 例一hF 叫工，kKd-7W 14 R4rr iJ*k !3* B4J h-修 fi一1Tn b - .,1j=PAn.4 七r1;- JT f *riFi ip 否EJ*h./*!V；1 1Uill0.rIf IFBli -I1 *ri!sl*：.x z而 TiT rTK. IfUAh： 3.ri L我h ,ir?f gx- Jljn：J? tWA；.*qmtf-.8r：1felt.IS -；事： 口1J!17 1中L*M*i-SiJ.闻宜9A T*- 粉i

14、vT Ci*F.r 邛TItE工ri Aruu.-jT：卜 -：鼻iTH*1*LF w.J /liinI1i1! 1骂.LLjn2t* ity; mr 1f77E VW i T4ir! T*w七 b认二次 AIF KT心E小,rtF2 . *1*e 1A小V(工La iV钳 界:MiIIV_ jlJ *=助胃一 %-igN帛 炉7TE V1Vl.鼻Jsr&FL;? JiQ ;Q*T ,那n*F1期.一 h h51HIzK心， rT再日.1J-i.7.ji ii门 -iT t :rxVK山 KPJiF rW ji,*V tT*si1图1重链测序结果及分析人源噬菌体抗体，经过基因序列测定表明，该抗

15、体的3讨论重链基因与已报道的人免疫球蛋白重链基因序列同a TNF是人体的一种正常成分，如何获取针对它 源性高达98 %，并且其可变区框架区和恒定区与多的高亲和性单克隆抗体一直是难题 。噬菌体抗体库个已报道的人免疫球蛋白第 ?家族的框架区和恒定 技术的出现为解决这一难题提供了新的途径 。我们 区相同。因此，我们筛选到的噬菌体抗体片段属于a从混合的噬菌体抗体库中直接筛选到了抗TNF的 人免疫球蛋白第？家族，这说明该基因编码的确实是一种人源单克隆抗体, 有广泛的临床应用前景。 , 克隆选择的压力很强 ,混合抗体库中可能还有 筛选a基因测序结果表明我们筛选到的4株抗体重链 其它能与TNF结合的抗体克隆

16、 , 但亲和性较低, 因6 的 DNA 序列相同 , 均为 681 bp , 编码 227 个氨基酸残而在克隆选择中也被淘汰 。由过去的报道也可看() 基 , 其中 1,119 残基位氨基酸为重链可变区VH, 出 , 在进行较少轮次的筛选时, 可以获得较多的克隆( ) 种类 , 但如果加强克隆选择的压力 , 或增加选择的次120,227 位为重链恒定区 1 CH1 。但在进行轻链测序时 , 发现这 4 株噬菌体抗体的轻链序列不仅各 数 , 所获得的克隆就会减少 。对于前两个问题 , 解决 不相同 , 而且都不能表达一条完整的蛋白 。这说明的方法是尽量提高抗体库的库容量, 例如使用未成 我们筛选

17、到的噬菌体抗体的轻链是缺失的 , 它们实 熟的淋巴细胞进行扩增和克隆 。我们使用混合的抗 际上是一种单重链抗体 。这说明了两个方面的问 体库也是这个目的 。对于第三个问题如果我们想题 , 一是单独的重链片段就足以与抗原结合, 这与 获得多个抗体克隆进行研究, 可以通过降低选择压Ward 等人 报 道 的 结 果 一 致 , 以 此 重 链 基 因 为 基 力 , 例如减少筛选次数的方法来解决, 但这样获得的 础 , 我们可以方便地构建编码双特异性 TOC o 1-5 h z 蛋白的基因 , 噬菌体抗体可能结合活性较低。提供更有价值的蛋白产物。另外, 在抗原抗体结合反应中 , 重链可变区起主导作

18、用 , 轻链可变区为辅参考文献助因素 , 因此我们可以筛选的重链为基础, 重新构建 1 Huse WD , Sastry L ,Iverson SA et al . Generation of large combinatorial 相应的轻链二级库,进而筛选到具有更高亲和性的 library of the immunoglobulin repertoire inphage lambda . Science , 抗体 。我们进行的这几方面工作结果即将发表。 ()1989 , 246 10: 1275 沈倍奋 , 黎燕 , 赵恩峰等 . 肿瘤坏死因子基因克隆表达及其抗瘤 我们从混合的抗体库中只筛选到一个重链基2 () 活性的研究. 中国免疫学杂志 ,1993 ,9 1:22 因 , 这可能有三个方面原因 。首先是混合抗体库的 CarlosF , Burton DF. Monoclonal Antibodies from Combinatorial Li2 3容量不够大 , 不能完全保证模拟体内所有抗体 , 因而 braries Course on Cold SpringHarbor Laboratory. 1993 刘怀田 , 王海涛