基因编辑技术0001

1、生物学研究最具影响力技术：“基因编辑技术”大盘点2014 年 10 月 29 日，Nature 杂志上发布了名为Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice” 的研究论文，据悉，该文章发布了一种超越 CRISPR 的基因组编辑新技术，而CRISPR技术在今年被Nature Methods评为在过去十年中对生物 学研究影响最深的十大技术之一。新方法不需要内切酶在特异位点剪切DNA，也不需要使用启动子，大大降低了新基因自 身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。该技术使用一种常用的病

2、毒一一改良的腺相 关病毒（AAV）。改良的病毒载体中，所有的病毒基因被删除，只保留了治疗基因。再利用 同源重组，将目标基因插入，达到基因编辑的目的。在了解这项新技术有点之后，有必要了解什么是基因编辑技术及基因编辑的三大利器： ZFN （锌指核酸酶）、TALEN （转录激活样效应因子核酸酶）和CRISPR/Cas9 （成簇规律间隔短 回文重复技术）。基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点 InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因 编辑。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域， 该

3、技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物;在医辽领域， 基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因， 达到基因治疗的目的等。因此，基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，基因编辑技术本质上均是利用非同源 末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内 切酶完成的DNA序列改变。因此，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别 区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的 DN

4、A识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结 构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA 结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再 启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。基因编辑技术优缺点：1）ZFN的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计ZFN实现靶基因的修饰，但也有其发展的局限性,ZFN的识别结构域中存在上下文依赖效应， 使得ZFN设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足 要求的ZFN

5、，也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的 ZFN作用位点，并且在已经成功运用的ZFN的报道中，大多数研究者并不公布其ZF序列。 所以，在ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术困难。另外，由于ZFN的脱靶切割会导致 细胞毒性，使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。2）相比ZFN技术，TALEN使用了 TALE分子代替ZF作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决了 ZF对于DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与DNA碱基是对应的，并且对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定，这相对于ZFN的设计要简单得多。但是 在构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，

6、需要大量的测序工作，对于普 通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，使用成本较高；3）相较于ZFn和TALEN两种人工核酸酶技术，CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原 核生物RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是由crRNA指导的，对靶序列的识别是RNA 与DNA的碱基配对过程，相比蛋白质对DNA序列的识别要精确更多，降低了脱靶切割的 几率，减低了细胞毒性。而且CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互补的RNA即可， 过程相对于TALEN更为简单和廉价，普通的实验室也可以自行完成构建，这大大提高了基 因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9系统也存

7、在着一些不足。首先，Cas9蛋白对 于目标序列的切割不仅仅依靠crRNA序列的匹配，在目标序列附近必须存在一些小的前间 区序列邻近基序（PAM），如果目标序列周围不存在PAM或者无法严格配对，则Cas9蛋白 不能对任意序列进行切割。最后，和ZFN及TALEN技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何 控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。4）相比于CRISPR技术，新技术避免了使用核酸酶和启动子有可能产生显著不利影响， 不用担心该技术如果用于人类，有可能会在意外的位点切割DNA破坏或是杀死细胞，或者 启动子可能对邻近基因的表达造成不利的影响，引起癌症或者其他的疾病。

8、也避免了外源的 细菌蛋白可能引起患者的免疫反应。总之，这一研究发现可能给成为CRISPR基因编辑技术的一种替代选择。TALEN、ZFN （锌指核酸酶）和CRISPR/Cas9三大基因编辑技术网络资源和平台资源如下 表。表格来源： Kelly J. Beumer, and Dana Carroll. （2014） Targeted genome engineering techniques in Drosophila. Methods, in press, DOI: 10.1016/j.ymeth.2013.12.002.网址基本功能TAL effectorhtlp7AAvw. geno m-e

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