临床微生物标本培养前处理课件

1、 临床微生物标本培养前处理张秀珍标本采集处理血液培养相关问题脑脊液相关问题粪便相关问题生殖道标本相关问题脓,吸出液及组织标本相关问题痰标本相关问题咽标本相关问题真菌培养相关问题尿标本相关问题血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以下菌应视为非病原菌(除非1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml#135C 空气中孵育5天每天检查浊度并翻转培养瓶#2#318小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养革兰阳性球菌接种血平皿奥普托欣试验革兰阴

2、性杆菌接种血平皿和麦康凯平皿革兰阴性双球菌或球杆菌接种巧克力平皿和血平皿CO2中孵育72h#5#4将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生对重要病原菌进行鉴定和药敏试验#6例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎链球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution血培养是诊断败血症最有价值的手段败血症是一个非常严重的问题.血液中的微生物在3分钟内到达每个器官.在死于败血症的患者中,尽管采用抗生素给与合适的治疗，1/4的人死亡时，血中循环的微生物为10/cc或更少 Septicemia微生物或其产物在血液中引起疾病循环的 CFU/ml vs. 病原体成人 (1

3、2 岁): 1 CFU/ml金黄色葡萄球菌 27%铜绿假单胞菌55%大肠埃希菌62%其他菌种40%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle.循环的 CFU/ml vs. 病原体儿童: 5 CFU/ml任何病原体19% 10 CFU/ml任何病原体27%新生儿: 4 CFU/ml大肠埃希菌26%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington

4、, Seattle, York Hosp., York, PA. 1 CFU/ml任何病原体42%用于培养的血液体积 体重 磅 千克体积 (ml)/穿刺总量/2次穿刺1% 全血体积% 总血液体积199042204040 ml1-2%体积% 阳性血培养结果 vs. 采集的套数%99%89%80%真阳性20 ml/套Mayo Clinic Study立即获得足够血液并且开始抗生素治疗从不同部位获得2-3套血培养(40-60ml血液) 最好在5分钟内采集#1#2采集血培养时间的重要性9% +14% +9% +11% +发热高峰前12-2.5小时发热高峰前2.5-0.5小时发热高峰期间发热高峰后1-1

5、2小时166 病人105 病人199 病人258 病人Thomson et al. 1991. ASCP. Mayo Clinic Study要学会导管相关感染的诊断关键点: 患者必须有菌血症检测导管相关感染移走导管 Maki Roll (半定量)超声波降解和稀释 (定量)通过管腔抽吸 (定量)保留导管管腔刷定量培养 (CVC & 外周血)达到阳性的时间 (CVC & 外周血)两个血培养瓶必须同一时间抽取CVC阳性报警时间(TTP)比外周血快 2 小时短期插管 81% 敏感性 & 92% 特异性长期插管 93% 敏感性 & 75% 特异性不需要拔掉导管-阳性报警时间Raad, I. et al

6、. 2004. Ann. Int. Med. 140:18.6138 份即时血培养; 191份两个血培养瓶中鉴定的细菌相同 (25份不同). 108 (1.8 %) 有导管相关性感染; 9.8% 仅仅只有CVC培养阳性.Maki 滚动法导管尖阳性培养结果导管血在外周血阳性之前2 小时内阳性 报告: CVC不可能是菌血症的来源2.导管血在外周血阳性 2 小时之前阳性 报告: CVC 可能是菌血症的来源3. 只有其中一瓶报警阳性 (如果所有瓶子中的血量足够)报告: 可能污染; 患者无菌血症根据阳性报警时间判读污染细菌血培养污染定义为在几次血培养中单个血培养下列细菌阳性:凝固酶阴性葡萄球菌棒状杆菌

7、微球菌丙酸杆菌 芽孢杆菌血培养污染 vs. 皮肤消毒% 污染Studies from Baylor, Nashville, & France败血症 vs. “污染的” 血培养%阳性Mayo Clinic Study心内膜炎菌血症皮肤定植细菌#血培养套数脑脊液（CSF)培养主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌最少1ml，最佳5ml医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。# 11500g离心15分钟（可能的话）# 2# 3用吸管吸去上清，留下1cc的脑脊液沉淀X注意：不要倾倒# 4滴一滴沉淀于

8、巧克力平皿和血平皿上下吸取10次以上混匀沉淀# 5CO2中孵育72小时# 6将一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞则强烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution脑脊液（CSF)培养主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌最少1ml，最佳5ml医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。# 11500g离心15分钟（可能的话）# 2# 3用吸管吸去上清，留下1cc的脑脊液沉淀X注意：不要

9、倾倒# 4滴一滴沉淀于巧克力平皿和血平皿上下吸取10次以上混匀沉淀# 5CO2中孵育72小时# 6将一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞则强烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution#1#2接种血平皿，麦康凯平皿，Hektoen或DCA，若怀疑弧菌则还接种TCBS平皿。37 C 空气孵育48h#3粪便标本采集后30分钟内进行接种或置于cary-blair运输培养基中#4粪便培养重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在常规的实验室可能

10、检测不出）选择血性或脓性的部分进行接种血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性杆菌需进一步鉴定将菌落接种TCBS或含0-6盐浓度的肉汤中。麦康凯、HEK或DCA平皿上不利用乳糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。氧化酶阳性、湿润的米色菌落革兰染色显示弯曲或螺旋形的杆菌弯曲杆菌属Campy琼脂#6 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution#5将菌落接种至Campy琼脂或使用滤纸法。微需氧环境下37-42 C 孵育 72 hCO2孵育72h TM培养基上寻找淋球菌，血平皿上寻找酵母菌# 2血平皿& Thayer-Martin平皿# 1# 1接种Thayer-Ma

11、rtin培养基&革兰染色将拭子在玻片上滚动制成一个细胞厚度的涂片；寻找“线索细胞”C. 怀孕35-37周的孕妇阴道或肛拭子营养肉汤中孵育过夜血平皿上次代培养检测B群链球菌# 1# 2CO2中孵育48小时D. 女性的阴道拭子# 1血平皿上寻找酵母菌，T-M培养基上寻找淋球菌革兰染色辅助诊断细菌性阴道病# 1# 230 min内将拭子置于0.5ml生理盐水中检测滴虫T-M培养基上的淋球菌血平皿上的酵母菌A. 女性的子宫颈或肛拭子B. 男性的尿道拭子非病原菌金黄色葡萄球菌任何革兰阴性杆菌，包括大肠杆菌和变形杆菌B群溶血链球菌（GBS)，仅为孕妇报告生殖道标本培养主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&

12、女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群溶血链球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution阴道感染的病因学From a major U.S. Ob/Gyn department.衣原体混合性传播疾病念珠菌女性百分比细菌性阴道炎正常女性生殖道感染的症状和致病菌子宫颈炎阴道炎其他细菌性阴道炎念珠菌阴道毛滴虫衣原体淋病奈瑟菌支原体/脲原体损伤:单纯疱疹人乳头瘤病毒梅毒螺旋体触染性软疣 痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌病人需用水清洁口腔，深咳

13、肺部痰，不要唾液#1进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果#2#3好：很少扁平上皮细胞奥普托欣纸片CO2中孵育48小时#4接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿#5拒绝：大量 扁平上皮细胞肺炎克雷伯菌对重要病原菌进行鉴定&药敏试验金黄色葡萄球菌肺炎链球菌胆汁溶菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution奥普托欣流感嗜血杆菌有意义的细菌浓度值（CFU/ml）标本有意义的浓度 CFU/ml自然咳痰107诱导痰不确定气管内吸取物106支气管肺泡灌洗液104保护性毛刷103支气管灌洗液不做培养气管内吸取物加等量的N-

14、乙酰-L-半胱氨酸或溶痰剂漩涡震荡30s加0.01ml标本至1.0ml的TSB每个平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麦康凯平皿1：100稀释1：2稀释生长出50个菌落支气管肺泡灌洗液将所有标本装入50ml离心管内离心20min，混匀10ml沉淀液，漩涡震荡30s每个平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麦康凯平皿Use pipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀释）生长出10个菌落制作涂片（细胞离心)保护性毛刷将毛刷置于1ml稀释液中震荡30s每个平板涂0.01ml血平皿巧克力平皿麦康凯平皿生长出10个菌落Use PRAS if anaerobic若怀疑厌氧菌则使用PRAS制作

15、涂片（细胞离心)脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌用酒精消毒伤口 周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子#1接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生#2#3铜绿假单胞菌中孵育48小时#4对1或2种重要病原菌进行鉴定&药敏试验金黄色葡萄球菌为主溶血链球菌肺炎克雷伯菌混合的2种肠道革兰阴性杆菌：2种均报告；当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。 Ellen Jo

16、Baron 2007; Use with proper attribution#5咽部标本培养 主要病原菌：A群溶血链球菌。 选择性报告：溶血隐秘杆菌拭子擦取咽部和扁桃体。不要碰触舌头和面颊。将拭子擦拭血平皿（羊血或马血）的1/5区域在第一区贴相邻的两纸片：复方磺胺和杆菌肽# 1拭子# 2在烛缸中37C孵育过夜并检查平板；若阴性，继续孵育过夜总孵育时间48小时# 5# 3分区画线3或4区接种环溶血菌落， 0.5 mm, 对复方磺胺耐药，对杆菌肽敏感A群链球菌（触酶阴性）# 6杆菌肽& SXT 纸片# 4杆菌肽复方磺胺PYR阳性可确证A群链球菌# 7 Ellen Jo Baron 2007; U

17、se with proper attribution不要报告咽炎中非致病菌：金黄色葡萄球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌卡他莫拉菌溶血链球菌所有革兰阴性杆菌所有酵母菌报告结果： 1+ to 4+ A群溶血链球菌 或1+ to 4+ 非A群溶血链球菌 或未检出溶血链球菌 # 8# 9#1#2常规：接种沙氏平皿和Mycobiotic培养基。 30 C 空气孵育四周。对于皮肤癣菌：接种Mycobiotic和DTM培养基组织，皮肤刮取物或指甲：将一小块完整的标本插入琼脂表面#3重要的真菌：组织活检，痰，脑脊液，血培养皮肤癣菌：皮肤刮片，指甲刮片，根部的头发不要研磨组织：使用解剖刀将其切成小块#4真菌培养 重要

18、病原菌：新型隐球菌，人芽囊原虫 ，皮肤癣菌，和 其他真菌（考虑标本来源和病人情况）拭子仅用于酵母菌的分离接种血平皿和沙氏平皿 Ellen Jo Baron 2008; Use with proper attribution#6将标本研于一滴10%KOH，加盖玻片后镜检真菌接种后7天内每日观察平皿，之后每周两次光滑菌落酵母菌毛状菌落丝状真菌用通气胶带粘贴平皿的侧面或两边#5#1babUrine Culture尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌#2接种血平皿和麦康凯平皿#3空气孵育24小时收集中段尿a#4菌落计数0.001m

19、l接种环若 2 种菌生长，对每种菌进行鉴定和药敏试验；若2种菌生长，报告“混合菌群”#5注意: 革兰阴性杆菌在血平皿和麦 康凯平皿上均生长良好革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好GNR#675,000 cfu/ml50,000 cfu/ml100,000 cfu/ml Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attributionGPC尿道感染每年850万例尿路感染, 90%为女性1/2.5个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流肾脏膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道膀胱肾盂 血流尿培养的划线方式第一区 = 50,000 cfu/ml第二区= 75,000 cfu/ml第三区= 100,000 cfu/ml沿中