临床生化自由基NO生物学课件

1、临床生化第一章 自由基与NO生物学第一节 自由基第二节 NO的生物化学1第一章 自由基与NO生物学一、概念 1、定义：自由基是指带有未配对电子的 原子、基团、分子等， 可以独立存在。 (O2+eO2 小圆点代表未成对电子) 特点： 化学性质特别活泼，容易和别的化学物质 发生化学反应. 第一节 自由基(free radical)O2HO23 每个人的身体内都免不了会产生自由基，因为人体要新陈代谢，就需要由氧化反应产生的能量，这些氧化反应就是自由基的重要来源。 人类在极端不良情绪下，如愤怒、紧张、恐惧等，也会产生自由基。另外，一些外来因素，如紫外线、X射线、电磁波、致癌物质、酒精、一些药物和污染物

2、质等，也会导致自由基的产生。 自由基的客观存在4许多疾病可称之为“自由基”疾病,其中包括我们常见的动脉硬化、中风、心脏病、白内障、糖尿病、癌症等。 “自由基”疾病:56自由基导致衰老的加速，衰老又使得人体在“消灭”自由基方面的功能减弱，自由基和衰老使得人体的健康陷入了一个恶性循环。 自由基导致衰老的加速7 2、产生: (A:B A: +B+)均裂法： A:B A +B H2O H + OH电子俘获法：异 裂均 裂均 裂电磁辐射, 热能如:线粒体呼吸链传递的氧化还原反应中可产生 例：Q QH QH2 H+eH+eO2O2O2O2e8 而氧是最容易得到电子的元素。科学家们发现损害人体健康的自由基几

3、乎都与那些活性较强的含氧物质有关-如活性氧。9 二、活性氧的概念活性氧 指氧的某些代谢物以及一些反应产生含氧产物， 其特点是含氧，而且化学性质比基态氧活泼。 超氧阴离子 O2 氢 过 氧 基 HO2 过 氧 化 氢 H2O2 羟 自 由 基 HO 脂 过 氧 基 ROO10活性氧的产生抗氧化系统线粒体中嘌呤分解代谢Cyt P450自氧化中性粒细胞和巨噬细胞辐射作用一级抗氧化防御系统-过氧化氢酶-超氧化物歧化酶(SOD)-谷胱甘肽系统(GSH)-抗氧化剂(Vc)二级氧化防御系统-DNA修复-蛋白修复和降解-解毒系统-膜修复-再生系统活性氧-脂质过氧化-DNA损伤-蛋白质氧化细胞损伤和死亡细胞的活

4、性氧的产生和抗氧化系统O2HO11 三、活性氧在机体内的生成及化学反应 （一）O2 (超氧阴离子)生成与化学反应 1、生成 12两条主要的呼吸链NADH氧化呼吸链琥珀酸氧化呼吸链1/2O2CoQCytbCytaa3CytcCytc1(FeS)FAD(FeS)FMN(FeS)NADH琥珀酸Cu131) 线粒体呼吸链传递的氧化还原反应中可产生 例：Q QH QH2 FMN（FAD） FMN（FAD） H+eH+eO2O2+eO2O2O2O2(当电子传递体数量不足或受抑制时易产生O2)e14 2)组织炎症区 中性粒细胞、巨噬细胞的磷酸戊糖通路 旺盛产生NADPH+H+增加 NADPH+H+O2 NA

5、DP+ +2H+2O2NADPH氧化酶 3)缺血缺氧时，黄嘌呤氧化酶催化反应中产生 次黄嘌呤+2O2+H2O 黄嘌呤+2O2 +2H+ 黄嘌呤氧化酶 + 2O2 + H2O 尿 酸+2O2 +2H+ 黄嘌呤氧化酶 4)药物、毒物在生物转化过程中产生，如阿霉素等 15岐化反应 O2 + O2 + 2H+ H2O2+ O2Haber-weiss反应 H2O2 O2 + HO + OH- 质子化反应 O2 + H+ HO2 (氢过氧基) O2 (过度金 属)Fe2+2、O2参与的化学反应 (水溶液中)161、生成 通过Haber-weiss反应产生 OH H2O的电离辐射: 均 裂 H2O H2O+

6、 H + OH H2O H + OH（二）OH生成与化学反应x、射线2、参与化学反应类型: 氢抽提反应、加成反应、 电子转移反应 OH对生物大分子损伤最明显，例如可使核酸分子中 相邻两个TT,失去模板作用，OH可引发膜脂质过氧化。 17 LH L + H2 OL LOO 脂过氧基 LOO + LH LOOH + L LO + LOO + H2O 脂质过氧化物生成:膜磷脂的多不饱和脂肪酸中的链式反应脂质过氧化作用是链式反应。氧自由基反应呈链式爆发。 OH O2 OH是脂质过氧化作 用的主要引发剂脂自由基脂质过氧化链式反应。（脂质过氧化物）18膜: 多不饱和脂肪酸中的链式反应19四. 活性氧对机体

7、的伤害蛋白 (功能降低:H2O2使 CuZnSOD中的Cu2+-Cu1+, 肽键断,蛋白交链, 羟化, 降解等)DNA 损伤: 环的破裂, 核苷酸链的断裂脂类(脂质过氧化作用): 老年色素的形成20自由基人类一些疾病与衰老的根源 攻击正在复制中的基因，诱发癌症发生 激活人体免疫系统，使人体表现出过敏反应 作用于酶系统，使皮肤失去弹性脆性增加导致静脉曲张水肿 侵蚀脑细胞，使人得早老性痴呆的疾病 氧化血液中的脂蛋白, 造成胆固醇向血管壁的沉积，引 起心脏病和中风 引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎 侵蚀眼睛晶状体组织引起白内障；侵蚀胰脏细胞引起糖尿病.21 大量研究已经证实，人体内本身就具

8、有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）.过氧化氢酶(CAT).谷胱甘肽过氧化物酶.维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽(GSH)-胡萝卜素和硒. 酶抗氧化剂22 在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。我国一些特有的食物(绿茶等)和药用植物(丹参酮)中，含有大量的酚类物质.23如何降低自由基对人体的危害 利用内源性自由基清除系统 发掘外源性抗氧化剂自由基清除剂 非酶抗氧化剂抗氧化酶(食物, 药用植物)24活性氧的产生抗氧化系统线粒体中嘌呤分解代谢Cyt P450自氧化中性粒细胞和巨噬细胞辐射作用一级抗氧化防御系统-过氧化氢酶-超氧

9、化物歧化酶(SOD)-谷胱甘肽系统(GSH)-抗氧化剂(Vc)二级氧化防御系统-DNA修复-蛋白修复和降解-解毒系统-膜修复-再生系统活性氧-脂质过氧化-DNA损伤-蛋白质氧化细胞损伤和死亡O2HO25六、 机体抗氧化防卫系统（一） 抗氧化酶1、超氧化物岐化酶（SOD）O2 + O2 + 2H+ O2 + H2 O2 Cu-ZnSOD 胞浆 MnSOD 线粒体 SODSOD2、过氧化氢酶（CAT）2H2O2 O2 + H2O CATFeSOD26 ROOH 2GSH NADP+ （H2O2） ROH GSSG NADPH + H+ 磷酸戊糖途径 （H2O） 3、 过氧化物酶 （主要是含Se的谷

10、胱甘肽过氧化酶 GSH-PX）GSH-PX （二）非酶抗氧化剂 VE、VC、GSH, 雌激素,中草药中某些成分如 丹参酮、黄酮、人参皂甙等过氧化物27自由基产生抗氧化系统一级抗氧化防御系统-过氧化氢酶-超氧化物歧化酶(SOD)-谷胱甘肽系统(GSH)-抗氧化剂(Vc)Free radicals-脂质过氧化-DNA损伤-蛋白质氧化细胞损伤和死亡生理作用自由基的稳衡性:28七. 自由基的有益作用 1、自由基与重要生物活性物质合成的关系 2、自由基的解毒作用 3、自由基与机体免疫系统的关系 29凝血酶原的合成与氧自由基的关系 O2CO2 “活性碳” 羧化酶 “活性碳”在羧化作用中起羧化剂的作用1、自

11、由基与重要生物活性物质合成的关系 返回节 凝血酶原前体羧化302、自由基的解毒作用 返回节 外来物质：药物、毒物，如各种麻醉 剂、杀虫剂、烷烃系列石油产品、致癌 物质、各种药品、脂肪酸等31 返回节 细胞色素P450通过羟化作用的解毒机制T：毒物、药物等32 吞噬细胞杀死侵入机体的有害微生物的最重要机理是能产生有毒的各种活性氧 呼吸爆发：当吞噬白细胞进行吞噬作用时，常与氧化代谢突然增长联系在一起 羟自由基的作用:白细胞中超氧阴离子与H2O2 产生 HO导致丙二醛产生(强力杀菌) 3、自由基与机体免疫系统的关系 返回节 33第二节 NO的生物化学 1980 纽约州立大学 Furchgott 发现

12、在生物体中的作用,90年代发现在多种生理, 病理中起作用.3435一、NO的生物合成 1、反应 NOS（NO Synthase） 一氧化氮合酶（不需要ATP） 一氧化氮合成酶（需利用ATP） NH2 C=NH2+ NH （CH2）3 HCNH2 COOH L-Arg+O2+NADPH+H+ NH2 C=O NH（CH2）3 HCNH2 COOH 瓜氨酸+NO+NADP+2H2ONOSCa2+、BH4等36NOS结构含血红素37I型 神经元型(neuronal NOS, nNOS）: 神经系统中有广泛的分布III型 内皮型(endothelial NOS, eNOS）: 首次在血管内皮细胞中发现

13、II型 诱导型(inducible NOS, iNOS）: 血管内皮细胞、神经元等I、III型合称原生型NOS或结构型NOS(活性受Ca2+/CaM调节，为Ca2+依赖性)。 2、 NOS分型与生化特性iNOS: 在病理状态下被诱导(非Ca2+依赖性)38 二、NOS的分布 1、nNOS 在神经系统中有广泛的分布。 用免疫组化技术发现： 大鼠大脑皮质、海马、纹状体中1%2%神经元含 nNOS 用原位杂交技术发现： nNOS mRNA在小脑中含量最高，其次是嗅球、海马、 大脑皮质等39 2、eNOS 1991年首次在血管内皮细胞发现，以后在其它种 类细胞发现如肾小管上皮细胞、大鼠海马锥体细胞 3

14、、iNOS 1991年首次在鼠巨噬细胞中分离到,现已发现多 种 细胞可表达iNOS,如心肌细胞、血管内皮细胞、神经元等。(病理状态: 细胞因子、细菌、创伤等多种刺激诱导iNOS表达)。 40 nNOS 具高度保守性，从大鼠和人脑中分离的nNOS的 氨基酸序列有93%相同 iNOS 在同一种类不同细胞中序列基本相同（99.7%） 但不同种属间保守性不及nNOS、eNOS 目前认为至少有3种基因编码NOS家族，三者之间有50%同源性。每种NOS种族之间同源性大约为8094%。 三、 NOS的基因表达41NOS基因表达受多种因子影响： nNOS 和eNOS : 基态时有表达. 多种神经损伤因素也可上

15、调nNOS表达. 血液流动上调eNOS表达.iNOS: 在静息细胞中无表达. 病理状态: 细胞因子、细菌、创伤等多种刺激可诱导iNOS表达。424344NO作用45NO如何起作用?46四、NO的胞内信号转导 GTP cGMP+PPi cGPK平滑肌松弛(平滑肌细胞) NO （+）1、NO/cGMP途径: cGMP之后的信号, 不同细胞中不同.鸟苷酸环化酶（sGC）控制离子通道, 抑制平滑肌 Ca+ 内流(cGMP依赖蛋白激酶)47482、激活环氧化酶(COX) 环氧化酶 前列腺素 前列环素 花生四烯酸 血栓素NO直接结合 （+）49 3、激活PKC 在肝细胞中有此反应，而巨噬细胞中则相反，抑制

16、PKC. 因细胞种类不同而异.PKC对代谢的调节作用:使底物靶蛋白的丝氨酸和（或） 苏氨 酸残基磷酸化，改变蛋白质功能 PKC对基因表达的调节作用: 转录因子和翻译因子 磷酸化504、对转录因子影响 可刺激立早基因(转录因子)表达(NO/cGMP途径) IBNF-BNF-B无活性复合物NF-BIBP活性NF-B移入细胞核激活基因转录:促炎症因子IL-6表达等 抑制核因子B激活（NF-B）51 1、作用于-SH 使含-SH酶及蛋白质失活 2、作用于金属离子 抑制FeS，干扰呼吸链 抑制顺乌头酸酶 (含FeS). DNA结合蛋白中含“锌指”结构，其中Cys(含SH)与Zn结合， NO可破坏此结构，

17、影响DNA结合蛋白与DNA结合。 3、使SOD的酪氨酸硝基化 主要原因是NO与O2反应生成ONOO- （过氧化亚硝基阴离子）,使 SOD 酪氨酸硝基化. 4、损伤DNA: 且损伤DNA ,导致细胞死亡. 。 五、NO的细胞毒性作用(病理状态诱导的NOS（iNOS)合成的NO主要发挥细胞毒作用)52第二章 糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂 第一节 糖蛋白第二节 蛋白聚糖第三节 糖脂第四节 细胞外基质 53蛋白 脂糖糖蛋白蛋白聚糖糖脂 糖蛋白(糖50%) 糖 脂 54第一节 糖蛋白 一、结构 短链寡糖 糖蛋白 糖苷键55糖苷键乙酰葡萄糖胺乙酰半乳糖胺天冬酰胺丝/苏氨酸N-连接糖蛋白O-连接糖蛋白56组成寡糖

18、链的单糖及其衍生物主要有7种： 葡萄糖（Glc） 半乳糖（Gal） 甘露糖（Man） 岩藻糖（Fuc） N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc） N-乙酰半乳糖胺（GalNAc） N-乙酰神经氨酸（NeuAc，唾液酸的一种） 57 寡糖链有不同糖苷键形式, 形成不同分支如1-2，1-3 1-2，1-3，组成糖链的糖基种类、数目、排列顺序不同，组成多种多样的寡糖链。寡糖链丰富的结构变化蕴藏着丰富的信息。寡糖链:5859“糖肽键”：即指糖基第1个碳原子上的羟基与多肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基之间脱水形成的糖苷键。（见后图） N-糖苷键: 由多肽链的天冬酰胺的酰胺氮 与N-乙酰葡萄糖胺羟基相连糖肽键O-糖

19、苷键: 由多肽链的丝/苏氨酸的羟基 与N-乙酰半乳糖胺羟基相连 60糖苷键天冬酰胺丝氨酸N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）N-乙酰半乳糖胺（ GalNAc ）N-连接糖蛋白O-连接糖蛋白61（一）N-连接糖蛋白 1、糖基化位点 AsnXSer/Thr （X为脯氨酸以外的任何氨基酸）2、N-连接寡糖链的结构 共性：五糖核心（见后图）高甘露型复杂型杂合型按与五糖核心连入糖基不同 62高甘露型复杂型杂合型2-9 Man兼两者63 3、N-连接寡糖链的生物合成糖链与肽键合成同时进行 第一阶段 寡糖脂质中间体的合成与转移（见后图） 在内质网 以长萜醇（多聚-顺-异戊烯醇dolichol,dol）作为糖链载

20、体，以UDP或GDP糖衍生物为糖基供体，由特异性糖基转移酶催化，直至形成G寡糖（一种14个糖基的寡糖），构成长萜醇焦磷酸寡糖, 即: 寡糖脂质中间体。 G寡糖转移到内质网腔与新生多肽中Asn-X-Ser/Thr中的Asn位点共价连接。64特异性糖基转移酶(G寡糖)65G寡糖修剪与延长66 在粗面内质网与高尔基体中，在相应糖苷水解酶和糖基转移酶作用下，糖键修剪、延长等改造，形成各型N-连接寡糖。 第二阶段 与肽键结合的寡糖链的修剪与延长高甘露型复杂型杂合型67（二）O-连接糖蛋白 1、O-连接寡糖链结构 糖基化位点的序列不清楚，但常在Ser、Thr密集区并有脯氨酸的序列中，O-连接寡糖链无共同核

21、心结构，糖链结构差异大。O-连接寡糖链结构 GalNAC-O-Ser（Thr）N-乙酰半乳糖胺682、O-连接寡糖键的生物合成 O-连接寡糖链的合成是在多肽链合成后进行的 GalNAC-O-Ser（Thr）GalNAC转移酶UDP-GalNAC糖基转移酶O-糖基化始于内质网，而加入末端糖基在高尔基体糖基12 GalNAC-O-Ser（Thr）无需寡糖脂质中间体的合成, 即无载体.(N-乙酰半乳糖胺)69二、糖蛋白中寡糖链的功能 糖蛋白 可溶性糖蛋白- 血浆蛋白等.膜糖蛋白 - 受体蛋白、离子通道蛋白等 寡糖链结构可影响蛋白部分的构象、聚合、降解、糖蛋白相互识别与结合等过程。 （一）寡糖链对糖蛋

22、白理化性质的影响 1、粘蛋白具有润滑、保护作用: 胃肠道,呼吸道中的黏液. 2、一般寡糖成份有抵抗外界变性因素的作用，稳定糖蛋白,抗蛋白酶水解.(体内蛋白大多数为糖蛋白)70 （二） 寡糖链对新生肽链的影响 1、 在肽链折叠并维持正常空间结构方面起作用 一些N-连接寡糖链参与新肽链的折叠, 维持其正 常空间结构 2、 影响糖蛋白在细胞内的分拣和投送。 71 （在内质网合成） （高尔基体内磷酸化）例：溶酶体酶 - 糖链 - 甘露糖-6-P 溶酶体膜上相应受体(甘露糖-6-P受体),酶进入溶酶体若末端甘露糖不被磷酸化，溶酶体酶血浆疾病72（三） 寡糖链对糖蛋白生物活性的影响 (部分糖蛋白:部分激素

23、,酶等) HMGCoA还原酶无糖链: 活性下降90% （四） 寡糖链的分子识别作用 精子与卵子识别、受体与配体识别、ABO系统中 血型物质 差异等均与糖链结构有关。细胞 之间传递信息,如接触抑制.参与细胞分化与器官的形成 （五） 寡糖链与细胞恶变有关: 寡糖链结构在恶性细胞中改变. (含岩藻糖糖蛋白出现).73第二节 蛋白聚糖(PG)一、分子组成(糖50%, ECM之一 ): 蛋白质 糖胺聚糖 （核心蛋白） 共价键细胞细胞核心蛋白包埋在糖胺聚糖中74（一）核心蛋白（见后图）与糖胺聚糖链共价结合的蛋白质称为核心蛋白。 蛋白聚糖通过特异结构域可锚定在细胞表面或细胞外基质的大分子上。 7576N-糖

24、苷键: 由多肽链的天冬酰胺的酰胺氮O-糖苷键: 由多肽链的丝氨酸的羟基蛋白质与糖胺聚糖链共价结合:77（二）糖胺聚糖: 由二糖单位重复组成,具大量阴离子, 稳定和支持细胞. 氨基己糖 -O- 己糖醛酸（or半乳糖）n （见后图） 六种:78糖胺聚糖的二糖单位7980特点：1、二糖单位重复排列线性结构，不分支 2、具大量阴离子的杂多糖 81二、蛋白聚糖的生物合成 1.在内质网合成核心蛋白的肽链，合成同时可加上糖链.2.在高尔基体, 特异的糖基转移酶催化，进行糖链修饰加工。以UDP-糖的形式加上单糖,而不是以二糖为单位.N-糖苷键: 由多肽链的天冬酰胺的酰胺氮O-糖苷键: 由多肽链的丝氨酸的羟基8

25、2三、蛋白聚糖的功能: 构成细胞间的基质是其主要功能 1.软骨、皮肤等结缔组织基质内，糖胺聚糖密集负电荷可吸收大量水分子形成凝胶状, 起机械保护作用，对维持组织形态及抗局部压力起重要作用。同时参与维持体内水和电解质的平衡. 500ml 水 / 1g透明质酸2.动脉壁含丰富透明质酸、硫酸软骨素等成分，与维持血管壁结构完整、通透性、弹性有关。3.肾组织合成蛋白聚糖, 增加渗透压, 促尿浓缩.4. 透明质酸阻止细菌进入机体或细胞.硫酸软骨素促伤口的愈合 835.蛋白聚糖密集负电荷, 因而易于胆汁酸盐, 碳酸钙结合, 阻止胆结石形成.6.细胞间基质中含有大量透明质酸, 可与细胞表面的透明质酸受体结合,

26、 影响细胞间的粘附, 细胞迁移, 增殖, 分化. 7、关节腔、胸腔、心包腔等含透明质酸有良好的润滑作用。 8、肝素抗凝血作用; 还可促血管释放脂蛋白脂酶,降解脂蛋白, 促脂肪分解, 调节血脂.84第三节 糖脂糖糖苷键脂类FA鞘胺醇85甘油糖脂: 分布在植物、微生物中为主 鞘 糖 脂: 动物细胞膜,特别是神经组织中含量高糖脂 一、鞘糖脂的化学结构与分类 1、结构 （见后图）2、分类： 中性鞘糖脂 糖链中仅有中性糖基 酸性鞘糖脂（即神经节苷脂，含唾液酸） 86神经酰胺和鞘糖酯FA87三、鞘糖脂的功能 1、是生物膜的组分，髓鞘组分-保护、隔离神经纤维.2、与免疫功能有关:诱导抗体产生.3、细胞识别功

27、能有关:糖链在胞外, 感知外界信息.eg:精卵结合.4、与细胞分化有关:细胞分化时, 糖脂发生改变,因而有关.5、作为跨膜信号传导的调节剂，调节细胞分化和增殖 （见后图） 88鞘糖脂的双重功能作为跨膜信号传导调节剂鞘糖脂89第四节 细胞外基质 细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 胶原蛋白 糖蛋白（纤连蛋白，层粘连蛋白） 蛋白聚糖9091一、胶原（Collagen）: 25% 机体总蛋白,来自成纤维细胞 （一）胶原的分子组成和分型 （1、2、3、4） 微温稀酸 超离为的二聚体和三聚体目前已发现有18种类型胶原，其中-型为常见胶原分子。（见后表）胶原92各型胶原蛋白特点

28、与分布93（二）胶原分子结构特点 1、氨基酸组成的特征： 甘（占1/3）、脯（占1/4）. 羟脯氨酸和羟赖氨酸为胶原特有. 缺少色氨酸、半胱氨酸。 2、分子构象特点： （见后页） 由三条-肽链组成，以右手旋转方式相互绕成三股螺旋。 94链之间为H键GlyProX三股螺旋形成的重要条件使不能形成螺旋9596原胶原的三股螺旋结构GlyProX两个原胶原分子赖氨酸残基侧链 末端氨基之间醛醇交联反应形成共价键侧向排列聚集成 胶原微纤维97原胶原分子侧向共价连接的醛醇交联反应98 （三）胶原的生物学功能 3. 在结缔组织损伤修复过程中起重要作用。(如 皮肤受损后，血管内皮细胞可合成型胶原，以及成纤维细胞

29、增生，并出现大量型胶原为主粗大纤维，有利伤口修复, 伤痕上有一层上皮: 含大量型胶原型胶原)。1、主要为结构蛋白: 皮肤、骨和软骨、肌键等组织支持物和填充物。 2、参于细胞分化.加胶原,促悬浮细胞分化99二、纤连蛋白（fibronectin，FN） (糖蛋白)细胞细胞基质血浆FN细胞FN(促血小板的凝集)分布:(不溶)主要由成纤维细胞合成主要由肝细胞,内皮细胞合成100（一）FN的肽链结构 FN由两条不完全相同的多肽链（A、B链），通过近C端的二硫键相连而形成二聚体。每条多肽链均可区分为7个功能性结构域，分别执行与细胞、胶原和肝素等结合的功能。（见下图）纤连蛋白的结构域C端C端101 FN肽链的结构由一系列“绊”状结构的同系物(AA不完全相同)重复单位组成，是FN最有意义的结构特征。纤连蛋白的三种同系物重复单位由二硫键由二硫键无二硫键102同系物（亦称内在序列、同源结构 internal sequence homology）型同系物 有12个重复，形同两个相连指圈，出现在片段 1、2、6, 结合纤维蛋白和胶原区域。型同系物 仅有2个重复，在片段2结合胶原的区域。型同系物 有16个重复单位，集中出