生物制药工艺学氨基酸类药物-氨基酸的生产方法讲义

1、第二章 氨基酸类药物第二节 氨基酸的生产方法掌握直接发酵生产氨基酸的操作要点； 通过赖氨酸发酵生产的工艺过程， 熟悉赖氨酸的发酵生产和产品的分离纯化工艺过程教学基本内容：2.2 直接发酵法直接发酵法的原理工业上， 发酵实质上是利用微生物细胞中酶的作用， 将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。初生氨基酸： 微生物通过固氮作用、 硝酸还原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸，或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸也称为初生氨基酸。次生氨基酸： 在微生物作用下， 以初生氨基酸为前体转化成的其它氨基酸。大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化

2、作用而产生。有些氨基酸可以以有机化合物和氨盐为前体，在相应酶作用下而产生。发酵法中氨基酸的碳链主要来自糖代谢中间产物，如草酰乙酸、a -酮戊二酸、赤藓糖-4- 磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、 3-磷酸甘油酸及分枝酸等。直接发酵法分类按照生产菌株的特性，直接发酵法可分为 5 类：使用野生型菌株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸的发酵生产；使用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如赖氨酸（高丝氨酸缺陷） 、亮氨酸（苯丙氨酸缺陷）等；由氨基酸结构类似物抗性突变株生产氨基酸，如赖氨酸（ S- （ 2- 氨基乙酸）-L-半胱氨酸（AEC）等；使用营养缺陷型兼抗性突变株生产氨

3、基酸，如高丝氨酸（蛋氨酸、赖氨酸缺陷，a-氨基-伊羟基戊酸AHV抗性）等；以氨基酸的中间产物为原料，用微生物将其转化为相应的氨基酸，这一方法主要用于很难避开其反馈调节机制，而难以用直接发酵法生产的氨基酸。如现已成功地用邻氨基苯甲酸作为前体物生产L- 色氨酸，用甘氨酸作为前体工业化生产L-丝氨酸。发酵法生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理，菌种诱变与选育，菌种培养、灭菌及接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤。（二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺构成动物、植物及微生物体所有蛋白质的氨基酸种类与构型均无任何差异，但植物体内所有氨基酸皆由 CO2 、氨和水合成，动物体除8 种必需氨基酸需从外界摄取

4、外，其余非必需氨基酸均可通过体内氨基酸之间的转化或碳水化合物中间代谢物而合成，而微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成所有氨基酸。目前绝大部分氨基酸皆可通过发酵法生产， 其缺点是产物浓度低， 设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。本文仅以 L- 异亮氨酸及L- 赖氨酸直接发酵法为例，说明发酵法的基本过程。1、L-异亮氨酸（L-Isoleucine , L-Ile ）的制备1 ） L- 异亮氨酸的结构与性质： L-Ile 存在子所有蛋白质中， 为人体必需氨基酸之一，分子式为 C6H13NO2 ，分子量为 131.17 ，结构式为：3 ）工艺过程菌种培养种子培养基组成（% ）为：葡萄糖2

5、 尿素 0.3 玉米浆2.5豆饼水解液0.1 （以干豆饼计） pH6.5 。二级种子培养基另加菜籽油 0.4 ，其余同一级种子培养基。一级种子培养： 1000ml 三解瓶中培养基装量为 200ml ， 接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床30c培养（冲程7cm ,频率105次/min） 16h。二级种子培养： 接种量 3.5， 培养 8h ， 如此逐级放大培养得足够量菌种。灭菌、发酵发酵培养液组成（% ）为 :硫酸铵4.5 豆饼水解液0.4 ，玉米浆2.0碳酸钙4.5pH7.2 ，淀粉水解还原糖初糖浓度11.5 。在5m3发酵罐中添加3吨发酵培养液，加热至118120C,维持在1.1 x

6、i05Pa压力，灭菌30min ,立即通冰盐水冷却至 25 C。接入1%菌种（v/ v）,维持180转/min的搅拌速度，升温至 3031 C,以0.2L/ （ min ?L） 通气量发酵60h ,在2450h之间不断补加尿素至0.6,氨水至0.27。除菌体、酸化发酵结束后，发酵液加热至100 并维持 10min ，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5 ，过滤除沉淀。离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5 %的流速进H十-型732离子交换柱（40 X100cm ),以100L去离子水洗柱，再以60C、0.5mol /L氨水按3L/min 的流 速进行洗脱，分部收集洗脱液。浓缩赶氨

7、合并pH312的洗脱液，7080 c减压蒸储、浓缩至粘稠状，加去离子水至原体积的1 4 ，再浓缩至粘稠状。如此重复三次。脱色、浓缩、中和上述浓缩物加去离子水至原体积的1 4 ，搅拌均匀，加2mol L 盐酸调pH3.5 ,加上1% (w/v)活性炭，70 c搅拌脱色1h。滤除活性炭，滤液减压浓缩至适当体积，用 2mol L 氨水调 pH6.0 ， 5 沉淀过夜,过滤抽千， 105 烘干得：L- 异亮氨酸半成品。精制、烘干每10kg L-异亮氨酸半成品加8L浓盐酸和20L去离子水，加热至80 C,搅拌溶解，加10kg 氯化钠至饱和，加工业液碱调 pH10.5 ，过滤，滤液用碱调pH 1.5 ，

8、5 放置过夜。滤取沉淀，用80L ，去离子水加热至80 搅拌溶解，加适量氯化钠和1% (w/v)活性炭，70 c搅拌脱色lh过滤，滤液减压浓缩至适当浓度，用氨水调 pH6.0 ， 5放置结晶过夜。次日过滤收集结晶，抽干，于105 c烘房中烘干得L-异亮氨酸成品。( 4 )检验应为菱形叶片状或片状晶体，含量应为98.5 %101.5 %,干燥失重不超过0.3 ，炽灼残渣不大于含量测定与L- 亮氨酸的规定相同。0.3% ， 氯化物不超过0.05 ， 硫酸盐不超过0.03 ， 铁盐不超过0.003 ,重金属不超过0.0015 ，砷盐不超过1.5ppm 。5 ） 作用与用途 L-Ile 为必需氨基酸，

9、 是复方氨基酸输液的重要成份之一。2 、 L- 赖氨酸（L-Lysine ， L-Lys ）的制备L-赖氨酸的结构和性质 L-赖氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。分子量为 146.20 ，结构为：菌种培养灭菌、发酵发酵培养液成分（）为淀粉水解糖13.5 ，磷酸二氢钾0.1 ，硫酸镁 0.05 ，硫酸铵 1.2 ，尿素 0.4 ，玉米浆1.0 ，毛发水解废液1.0 ，甘蔗糖蜜 2.0 ， pH6.7 ，灭菌前加甘油聚醚lL （指5m3 发酵罐） 。在 5m3 发酵罐中投入培养液3吨，在1.01 xi05Pa压力下，加热至118120 c灭菌30min , 立即通入冰盐水冷却至30 C

10、,按10% （v/v）比例接种，以1:0.6 （v/v）通 气量于30c发酵4251h ,搅拌速度为180转/min。发酵液处理：离心除菌体； 80 加热；离子交换：钱型732树脂;PH=5.0为饱和（串联）浓缩结晶：收集pH=8.014.0洗脱液（氨水洗脱）发酵法的基本过程发酵法生产氨基酸的基本过程包括菌种诱变与选育，培养基配制与灭菌处理，菌种培养、接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤。氨基酸发酵方式主要是液体通风深层培养法，其过程是由菌种试管培养逐级放大直至数吨至数百吨发酵罐。 发酵结束， 除去菌体， 清液用于提取、 分离纯 化和精制有关氨基酸，其分离纯化、精制方法及过程与水解法相同。直接发

11、酵法实例指通过特定微生物在以糖为碳源、以氨或尿素为氮源以及其它成分的培养基中生长，直接产生氨基酸的方法。L-异亮氨酸的制备工艺流程1 ）菌种培养种子培养基组成（）为：葡萄糖2 ，尿素 0.3 ，玉米浆 2.5 ，豆饼水解液0.1 ， pH6.5 。二级种子培养基加菜籽油，其余同一级种子培养基。一级种子培养： 1000ml 三角烧瓶中培养基装量为 200ml ， 牛肉膏斜面， 接种一环 AS1.998 菌种，摇床30、 16h 。二级种子培养：接种量3.5，培养 8h 。逐级放大。2 ）灭菌、发酵发酵培养液组成（） ：硫酸铵 4.5 ，豆饼水解液0.4 ，玉米浆2.0 ，碳酸钙4.5， pH7.

12、2 ，淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。灭菌，接种 1 菌种（ v/v ） ，搅拌，发酵。3 ）除菌体，酸化发酵结束后，发酵液加热至100 并维持 10min ，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5 ，过滤除沉淀。4 ）离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5 %的流速进H+型732离子交换柱（640 X100cm）, 以 100L 去离子水洗柱，再以 60,0.5mol/L 氨水按 3L/min 的流速 进行洗脱。分部收集洗脱液。5 ）浓缩赶氨6 ）脱色、浓缩、中和7 ）精制，烘干2.2.5 工艺过程评价微生物利用碳源、 氮源及盐类通过发酵法几乎可合成所有氨基酸。 该法的缺点是产物

13、浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。2.3 酶法转化概述酶法是应用完整的菌体或自微生物细胞提取的酶类制备氨基酸的方法。赖氨酸、色氨酸等均可用酶法进行制备。在发酵工业中早在1973 年就用固定化菌体的方法生产天冬氨酸。将酶或细胞进行固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反应器中制成所谓“生物反应堆” ，加入相应底物合成特定氨基酸，反应液经分离纯化即得相应氨基酸成品。其分离纯化和精制的原则及方法与水解法相同。酶工程法与直接发酵法生产氨基酸之反应本质相同， 都属酶转化反应， 但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化。两者相比，酶工程技术工艺简单， 产物浓度高，

14、转化率及生产效率较高， 副产物少， 固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。如聚丙烯酰胺凝胶包埋的精氨酸脱亚胺酶用于生产 L-瓜氨酸，37 c反应半衰期为140天，可连续使用 300 天。固定化酶凡限制在一定的空间范围内并能连续反复的使用的酶都称为固定化酶。通常采用的固定化方法可大体概括为四种类型： 吸附法、 共价偶联法、 交联法和包埋法。吸附法 这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，又可分：物理吸附和离子交换吸附物理吸附是通过氢键、疏水键和冗-电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。常用的载体有： 皂土、 硅胶、 氧化铝、 磷酸

15、钙胶和微孔玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原、赛珞玢以及火棉胶等有机吸附剂。最常用的交换剂有CM （羧甲基）纤维素、DEAE （二乙基氨基乙基）纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，约50150mg蛋白/g载体。共价偶联法这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。常用的载体有：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐共聚物、 聚苯乙烯、 尼龙等； 还有无机载体如多孔玻璃等。交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与惰性蛋白间、或酶分子与载体间进行交联反应以共价键制备固定化酶。包埋法将聚合

16、物的单体和酶溶液混合后， 再借助聚合促进剂 （包括交联剂） 的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。（ 1 ）胶格包埋最常用的包埋剂是聚丙烯酰胺凝胶，它以丙烯酰胺为单体、N, N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合而成。（ 2 ） 微囊型包埋是用直径几十到几百微米、 厚约 25nm 的半透膜将酶分子进行包埋固定化的方法。（ 3 ）脂质体包埋脂质体是指具有脂双层结构和一定包裹空间的微球体。辅酶及偶联酶的固定化辅酶物质的固定化一般采用载体共价偶联法。2.3.2 实例天冬氨酸和丙氨酸的制备工艺过程菌种培养大肠杆菌（ Esscherichia coli ） AS1.881 的培养 斜面培养基为

17、普通肉汁培养基；摇瓶培养基成分 （） 为玉米浆 7.5 ， 反丁烯二酸2.0 ， MgSO4 ?7H2O0.02 ，氨水调pH6.0,煮沸后过滤，500ml三角烧瓶中培养基装量50100m1。从新鲜斜面上或液体中培养种子， 接种于摇瓶培养基中， 37 振摇培养24h ，逐级扩大培养至10002000L规模。培养结束后用1mol /L HCl调pH5.0 ,升温至 45并保温 1h ，冷却至室温，转筒式高速离心机收集菌体（含天冬氨酸酶） ，备用。德阿昆哈假单胞菌（ Pseudomonas dacunhae ） 68 变异株的培养斜面培养基组成（）为蛋白胨 0.25 ，牛肉膏 0.52 ，酵母膏

18、0.25 ， NaC1 0.5 ， pH7.0 ，琼脂 2.0。种子培养基与斜面培养基相同，唯不加琼脂， 250ml 三角烧瓶中培养基装量为 40m1 。摇瓶培养基组成（）为L-谷氨酸3.0,蛋白陈0.9,酪蛋白水解液0.5,磷酸二氯钾 0.05 ， MgSO4 ?7H2O 0.01 ，用氨水调 pH 7.2 ， 500ml 三角瓶中培养基装量为 80ml 。将培养 24h 的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中， 30振摇培养8h ， 再接种子摇瓶培养基中，30 c振荡培养24h,如此逐级扩大至10002000L的培养罐培养。培养结束后用 1mol LHCl 调 pH 至 4.75 ，于 30保温

19、 1h ，用转筒式高速离心机离心收集菌体（含 L-天冬氨酸-伊脱竣酶），备用。细胞固定E?coli 的细胞固定取湿菌体 20kg 悬浮于 80L ，生理盐水（或离心后的培养清液） 中， 保温至 40， 再加入 90L 保温至 40的 12明胶溶液及10L1.0 戊二醛溶液，充分搅拌均匀，放置冷却凝固，再漫于0.25 戊二醛溶液中。于5c过夜后，切成35mm的立方小块，浸于0.25 %戊二醛溶液中5c过夜、蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶的固定化 E.coli ，备用。假单胞菌体固定取湿菌体 20kg ，加生理盐水搅匀并稀释至 40L ，另取溶于生理盐水的 5 角叉菜胶溶液85L ，两液均保温

20、至45 后混合，冷却至5 成胶。浸于600L2%KCl 和 0.2mol L 己二胺的 0.5mol L pH7.0 的磷酸缓冲液中，5下搅拌10分钟，加戊二醛至0.6mol /L浓度，5c搅拌30分钟，取出切成35mm 的立方小块， 用 2% KCl 溶液充分洗涤后， 滤去洗涤液， 即得含L- 天冬氨酸-伊脱竣酶的固定化细胞，备用。转化反应将保温至37c的lmol /L延胡索酸钱（含1mmol /L MgC12 , pH8.5 ）底物溶液按一定空间速度（Sv）连续流过生物反应堆I,控制达到最大转化率（95%）为限度，收集转化液制备 L-Asp或用于生物反应堆II的再转化。当需要生产L-丙氨酸

21、时，向上述转化液中加磷酸叱哆醛至0.1mmol /L浓度，调pH6.0 ,保温至37 C,按一定空间速度流入1.515 xl05Pa压力下的生物反应堆控制达到最大转化率（ 95%）为限，收集转化液，用于制取 L- 丙氨酸。5）产品纯化与精制生物反应堆I转化液经过滤澄清，搅拌下用 1mol /L HCl调pH2.8 , 5 C结晶过夜，滤取结晶，用少量冷水洗涤抽干， 105 干燥得 L-Asp 粗品。粗品用稀氨水溶解（pH5 ） 成 15 溶液， 加 1%（wv） 活性炭， 70搅拌脱色1h过滤 ,滤液于 5 结晶过夜，滤取结晶， 85真空干燥得药用 L-Asp 。生物反应堆II转化液过滤澄清，

22、于6070 c下减压浓缩至原体积的50 % ,冷却后加等体积甲醇，5结晶过夜，滤取结晶并用少量冷甲醇洗涤抽干， 80 真空干燥得L-Ala 粗品。 粗品用 3 倍体积（wv） 去离子水于80 搅拌溶解，加 0.5% （wv） 药用活性炭于70搅拌脱色1h ， 过滤， 滤液冷后加等体积甲醇，5结晶过夜，滤取结晶，于80真空干燥得药用L Ala 。5 ）检验6 ）作用与用途 L-Asp 有助于鸟氨酸循环，促进氨和 CO2 生成尿素，降低血中氨和 CO2, 增强肝功能，消除疲劳，用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时 L-Asp 和 L-Ala 都是复合氨基酸输液的原料。2.3.3 酶法转化工艺评

23、价（ 1）酶法是利用微生物特定的酶系作为催化剂，使底物经过酶催化生成所需的产品，由于底物选择的多样性，因而不限于制备天然产品。借助于酶的生物催化，可使许多本来难以用发酵法或合成法制备的光学活性氨基酸，有工业生产的可能。虽然酶法生产氨基酸具有工艺简单、 周期短、 耗能低、 专一性强、 收率高等特点，但要将它们应用于工业化生产，还需要进一步的研究。如何获得廉价的合成底物和酶原是这一方法能否成功的关键。近年来，随着基因重组技术的进步，使酶法生产氨基酸技术更具有光明的前景。酶拆分法制备L-苯丙氨酸L-苯丙氨酸(L-phenylalanine , L-phe )的结构与性质 L-phe ,存在于所有蛋白

24、质中， 为人体必需氨基酸之一， 其分子式为 C9H11NO2 ， 分子量为165.19 ，结构为：酶拆分 DL-Phe 的原理： DL-Phe 与醋酸酐反应生成乙酰-DL-Phe (Ac-DL-Phe) ， 氨基酰化酶可专一性水解Ac-L-Phe 的酰胺键生成L-Phe ， 而不水解 Ac-D-Phe 酰胺键，再利用 L-Phe 与 Ac-D-Phe 在水中溶解度的差异进行分离。Ac-D-Phe 又可经消旋生成Ac-DL-Phe ， 再行水解和分离， 如此反复进行，可将 DL-Phe 全部转化为 L-Phe 。 DL-Phe 拆分的基本反应过程如下：固定化氨基酰化酶的制备取 DEAE-Seph

25、adex A-50 于去离子水中充分浸泡后，依次用 10 倍量 0.5mol L HCl 和 0.5mol L NaOH 溶液搅拌处理30min ，再用去离子水洗至中性，然后依次用 0.1mol L 及 0.01mol L 的pH7.0磷酸缓冲液处理12h,滤干备用。另取培养4050h的米曲扩大曲用6倍量去离子水分两次抽提，滤去残渣。滤液用 2mol L NaOH 溶液调 pH6.77.0 ，按 100L 酶液加 1kg 已处理的湿DEAE-SephadexA-50 的比例混合，于 04c搅拌吸附45h,滤取DEAE-Sephadex A-50，依次用去离子水、0.1mol /L 醋酸钠、0.

26、01mol /L 的 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤34次，滤干得固定化氨基酰化酶，加1 %甲苯后于冷库中贮存，备用。Ac-DL-Phe的制备 将DL-Phe、冰醋酸及醋酸酊按1 ：7：1 (w/V/v) 的比例加入反应釜中，90 c反应45h ,回收醋酸，浓缩液加一定量去离子水， 再浓缩至一定体积，冷却结晶，滤取结晶于60 真空干燥得Ac DL Phe 。酶水解在 1000L 反应罐中加700L 0.1mol L Ac-DL-Phe 钠盐溶液，搅拌下滴加6mol /L HCl至pH6.77.0 ,加1520kg固定化氨基酰化酶，50 c反应4 5h ，过滤，滤液待分离L Phe ，固定化酶再用于

27、转化。分离纯化 上述滤液用6mol /L HCl调至pH4.85.1 ,减压浓缩至35L 左右， 浓缩液于0 结晶过夜，滤取结晶并用 10L 冷乙醇洗涤三次， 抽干 ,于 80烘 34h ， 得 L Phe 粗品。 滤液和洗涤液合并后减压浓缩至20L 左右， 得 Ac-D-Phe 溶液，待消旋和再转化。精制 取 50L 去离子水于100L 反应罐中，加热至95100 ，投入 5kgL Phe 粗品，搅拌溶解，加药用活性炭0.25kg ，搅拌脱色3min 。趁热过滤，滤液转移至200L 结晶罐中， 冷却至 40， 加 50 L 40 95乙醇， 用 6mol/L HCl调pH5.5 ,于0 c结晶过夜，滤取结晶，用10L冷乙醇洗涤34次, 抽干，于80 c干燥34h。母液浓缩回收L-Phe结晶，所得结晶如上法重结晶 一次， 得药用 L Phe 。 结晶母液及洗涤液合并,减压浓缩后转入粗品母液， 待