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文档简介
1、1荧光原位杂交技术及其在医学中的应用FISH methods and its medical application一、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)60年代 Pardue Gall 建立(一)方法与原理:制备DNA探针(用生物素或荧光素标记)(下图)变性制备CS或间期细胞标本变性处理探针与待测DNA杂交洗脱用荧光素标记的生物素亲和蛋白使杂交区发荧光(信号放大)(下图) 荧光显微镜检测2(二)探针制备方法1.缺口平移法(Nick translatrion)用生物素(biotin)标记dUTPDNA酶切口DNApolymerase
2、53外切酶活性DNApolymerase 53聚合酶活性3BdUTP45335DNAse5335OHpDNA聚合酶标记核苷酸GGCOHOHOHOHpBBGCUAUA53355 33 5分子杂交与信号放大5BBB荧光素亲和蛋白抗体探针待测基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略)2.随机引物法(random primer):6聚核苷酸 klenow酶6FISH ProcedureDenature the chromosomesDenature the probeHybridizationFluorescence stainingExamine slides or store in the dar
3、k7(三)探针种类1)探针池探针(cs涂抹探针):可结合在整条CS上每一部位。24色(常CS22条XY)89Whole chromosome probes10Whole chromosome probes 112)着丝粒探针:结合于着丝粒处,检测间期核内DNA数(CS数)121314Repetitive sequence probes3)端粒探针:结合于端粒处15164) 特异位置探针 :cs某一具体位置探针 例:Yq12 repetitive probe1718位点特异性探针5)染色体臂涂抹探针:结合于cs的q或p上。19(四)探针标记方法间接标记(前述) 时间长 信号明显直接标记 时间短
4、信号弱20二、FISH种类: 以FISH过程中探针结合部位或探针颜色的不同,将FISH分为多种。21221.Centromere Single Color FISH232.Single Color FISH (Telomeres)243.Dual color FISH254 多色荧光原位杂交265.Spectral Karyotyping (SKY)(光谱核型分析)276. 24 colors FISH287.M-FISH with telomeres and centromeres29M-FISH with chromosome banding specific probes308.间期FI
5、SH三、 FISH优点( Advantage): less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods31FISH - a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent moleculesidentify the presence and location of a re
6、gion of DNA within morphologically preserved chromosome preparations, then can identifies chromosomal abnormalitiesoften used during M phase but is now used on interphase as well32四、FISH在医学中的应用举例1、用已知探针检测未知CS畸变332、用显微切割方法检测未知CS畸变 显微切割PCR CS特异探针池(黄色荧光) 与正常人CS杂交(例:2号染色体某段发黄色荧光) 结果?343、产前诊断 例:检测间期细胞内DN
7、A分子数 例:21三体例:18三体354、植入前诊断36Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)37图示1例13/14罗式易位携带者的胚胎植入前FISH诊断资料:一对6年不育,女,32岁,cs正常,男34岁,核型:45,XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用单精子卵泡浆(intracytoplasmicsperm injection,ICSI)辅助授精,胚胎发育到3天6-8细胞期取出一个细胞进行双色FISH检测。参图:用13q和14q探针,见核中2个13号(绿色)和2个14号(红色)信号细胞,表明?38移植后18周做羊水细胞CS检查3
8、9PGD5、肿瘤诊断 肿瘤诊断探针检测间期细胞内DNA分子数肿瘤细胞内有癌基因扩增4041肿瘤诊断42慢性粒细胞白血病43慢性粒细胞白血病44慢性粒细胞白血病456.微小染色体畸变检测46Microdeletion 7.遗传病诊断 (图)例1:家系1 FISH结果用Xcs着丝粒探针(绿色)和DMD exon46探针(红色)杂交。图示DMD男患者FISH结果:只有Xcs着丝粒绿色信号,无DMD exon46红色信号,说明?477.遗传病诊断 (图)48 图示:DMD男患者姐姐2条Xcs均有DMD Exon46信号(红色)。表明?7.遗传病诊断 (图)49图示:DMD男患者妹妹只有1条Xcs上有D
9、MD Exon46信号。表明?7.遗传病诊断 (图)50例2:家系2FISH结果在DMD患者母亲1/3淋巴细胞中仅有1条Xcs上有DMD Exon46杂交信号,另一条上无。7.遗传病诊断 (图)51图示:在DMD患者母亲2/3淋巴细胞中在2条Xcs上有DMDExon46杂交信号。A和B结果表明?7.遗传病诊断 (图)52例3:图示1复杂易位患者FISH结果(该患者致妻流产3次)核型:46,XY,t(5;20;16)(q35;p13;q21)三色FISH(5q绿色;16q橙色;20p蓝色)结果参图:a:5号;b:衍生5号;c:16号;d:衍生16号;e:20号;f:衍生20号.53例4 FISH
10、技术从母血中检测胎儿有核红细胞图示:孕早期母血中胎儿有核红细胞,可见YCS特异杂交信号。54例5 13q部分三体致斜颈、不对称脸、右脸小,用13q探针检测(黄色信号)。图示:2条13号CS,另一13号接到1号短臂上。55图示:该患者G带核型56例6 白血病患者骨髓细胞双色FISH 8、基因定位(略)(参下页图)附:FISH试剂盒例子(参资料)5758IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S439
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