API使用培训(共32张)(PPT 32页)

1、第1页，共32页。API系统-构成:试条由特別选择的生化反应小管API试条有多种类 各有相应的数据库 所有生化结果以同时间一并阅读第2页，共32页。API系统 试条由10, 20, 50.测试组成不等 结果：鉴定百分率 基本单位：条目（Taxa)- 种(Pseudomonas Aeruginosa)- 生物型号(E. Coli 1)- 属(Salmonella Spp.)- 一群菌种(Aeromonas hydrophilia/cavicie) 所引用的分类学跟国际认可的一样- International Journal of Systematic Bacteriology 资料库整个系统的心

2、脏第3页，共32页。优点：-标准化，简易化-在制造过程中，进行质控-FDA标准-用家可用ATCC菌种进行质控-系统化-操作简易-快速报告-20年经验，拥有菌种资料25000，鉴定系统的发源生化测试750-1500文献第4页，共32页。选条的标准第5页，共32页。革兰氏阴性杆菌分类 革兰氏阴性杆菌氧化酶 +非肠道菌鉴定API 20NE肠道杆菌鉴定API 20E氧化酶 -第6页，共32页。革兰氏阳性杆菌分类革兰氏阳性杆菌触酶 -触酶 +短小脱色含有异染颗粒slight discoloration(granulations)短球杆菌延长状杆菌细小不透光菌落20-25C 有动力37C 无动力李斯特菌鉴

3、定API Listeria乳酸菌鉴定API 50CHL棒状杆菌鉴定API Coryne大体积产芽孢杆菌芽孢菌鉴定API 50CHB第7页，共32页。定向试验第8页，共32页。革兰氏阳性球菌分类革兰氏阳性球菌凝固酶葡萄球菌鉴定API STAPH触酶 -触酶 +金黄色萄葡球菌溶血链球菌鉴定API STREP+-第9页，共32页。-在细菌学里最普遍的染色方法革兰氏染色步骤G()G()- 染色前，所有细胞是透明的- 结晶紫着色後用碘增加染料与菌体结合- 乙醇从G() 菌体洗脱结晶紫- 用番红液复染，革兰氏阴性菌呈粉红色，革兰氏阳性菌呈兰紫色第10页，共32页。接解酶试剂- 原 理 - 传统方法H2O2

4、2H2O + O2接 解 酶玻片法试管法第11页，共32页。氧化酶试验- 原 理 :TMPD氧化 TMPD氧 化 酶(TMPD = 2甲基一对一苯撑二胺)货号: 55922纸片:浸泡饱和TMPD储存: 2-8C于暗处有效期: 1年组成: 2x30片小瓶装 纸片货号: 70460储存: 2-30C于暗处组成: 1个小瓶 液体试剂(深紫色)(透明)第12页，共32页。氧化酶纸片法第13页，共32页。液体 氧化酶试剂试剂方法:- 用2个试管载1-2ml无菌水- 第一管为阴性对照: 加一滴OX试剂- 第二管为测试管: 加可疑菌落然后再加二滴OX试剂- 比较二支管的颜色: 阴性对照:透明, 浅紫色 结果

5、:OX(-) : 透明,浅紫色OX(+): 紫色, 深紫色第14页，共32页。生化鉴定容易使用第15页，共32页。API结果原理：-生化结果组合跟资料库內的典型条目(Taxa)作出比较-经计算後，鉴定百比率（%Id）机会率，指示出不同菌类的比较T值（T index）=指示出在同一個菌类的相似程度第16页，共32页。生化鉴定可靠及具创意的选择最典型生化普菌种 XT 值资料库生化结果 (菌种 X) (菌種X)第17页，共32页。API结果跟据T值及%Id的组合，作出评语：(i)Excellent Identification %Id 99.9及T0.75(ii)Very good Identifi

6、cation %Id 99.9及T0.75(iii)Good Identification %Id 90.9及T0.25(iv)Acceptable Identification %Id 80.0及T0(v)Doubtful profile其中一个生化反应出现严重违反典型生化结果第18页，共32页。API 20E / Rapid 20E- 肠道杆菌科细菌在环境中及动物产品中非常普遍，其中部份 (沙门氏、耶尔森氏)是致病菌-API 20E是常规鉴定中的标准-其他新鉴定系统比较的金标准-方便使用，4或24小时出报告第19页，共32页。API 20E试剂条接种要点先做氧化酶试验，氧化酶为阴性时接种A

7、PI 20E,氧化酶为阳性时接种API 20NE试剂条塑料培养盒中加水5 ml,放入试剂条，记录标本资料。取1个1mm 大小，1824hr菌龄的菌落，分散于5ml悬浮液（20150）中，使达0.5 Mac Farland 浊度。小心沿内壁加菌悬液到微量生化杯中。其中：有U形框标记的项目(CIT、VP、GEL)，将菌液加满；有下划线标记的(ADH、LDH、ODC、H2S、URE、)，加好菌悬液后，用无菌液体石蜡封口。剩余的菌液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。孵育盒放入37摄氏度温箱培养24小时。第20页，共32页。A

8、PI 20E反应结果阅读要领（）一、若GLU（葡萄糖）为阳性，则记录GLU的结果，在TDA、IND、VP孔中加入相应的附加试剂，1分钟内读取TDA、IND的结果，510分钟内读取VP的结果。同时读并记录取其它反应的结果，用生化鉴定结果组成一个7位数编码。二、若GLU(葡萄糖)为阴性，但有多于2个的反应呈阳性，则按上述方法读取并记录结果。三、若GLU（葡萄糖）为阴性（非发酵菌），且其它呈阳性的反应不多于2个，则不要加试剂，放回温箱中再培养 24 hr后按第一条的方法读取结果。同时用次代培养物接种2个API OF培养基证实葡萄糖代谢类型；接种1个API M培养基观察动力；划线接种MacConkey

9、平板。培养24hr后将其结果记录到API 20E报告单，与生化鉴定结果一起得到一个9位数编码。第21页，共32页。API 20E反应结果阅读要领（）ONPG：淡黄色黄色为阳性，无色为阴性。ADH、LDC、ODC、URE以苯酚红为指示剂，橙色红色为阳性，黄色为阴性。CIT：管口处出现兰色为阳性，黄色绿色为阴性。H2S：黑色为阳性，无色浅灰色为阴性。 TDA、IND、VP加试剂后出现红色为阳性,不出现红色为阴性。 GEL：黑色素扩散为阳性，不扩散为阴性。GLUARA为糖类的酸化反应，指示剂溴百里香酚兰显黄色为阳性，蓝、绿色为阴性。第22页，共32页。GLU为阴性时，记录其结果，并在GLU孔中按先后

10、顺序分别加一滴NIT 1和NIT 2试剂，出现红色时 NO2为阳性，N2为阴性；不出现红色时，加少许Zn粉，此时出现红色，则NO2为阴性，N2为阳性。有动力，MOB为阳性，无动力则为阴性。 麦康凯平板上生长，McC为阳性，不生长为阴性OF培养管下部变色为发酵型，OF-F为阳性，下部不变色OF-F为阴性；OF培养管上部变色为发酵型，OF-O为阳性，上部不变色OF-O为阴性API 20E反应结果阅读要领（）第23页，共32页。API 20NE-非发酵G(-)杆菌存在于空气、水及表面-部份细菌（如绿脓假单胞菌）为致病菌-试条主要由传统生化反应及同化反应小管 所组成-64条目(Taxa)-非发酵G(-

11、)杆菌的标准鉴定方法第24页，共32页。API 20NE试剂条接种要点（1）先做氧化酶试验，阳性者接种API 20NE。塑料培养盒中加水5 ml,放入试剂条，记录标本资料。取1824hr菌龄的菌落，分散于ml盐水（20040）中，使达0.5 MacFarland 浊度（A液）。取A液200 ul(滴），加入AUX培养液中，小心混匀避免产生气泡，制成同化试验接种液（B液）。用A液按API 20E相同的方法接种生化试验杯孔（NO3PNPG其中，GLU，ADH,URE用液体石蜡封口）第25页，共32页。用B液接种同化试验杯孔(下面有三条红线者）。使液面与杯口平齐B液黏度很大，特别注意不要使菌悬液堵住

12、杯口，形成大的气泡，影响反应结果。严格无菌操作，避免空气中的杂菌污染同化试验剩余的A液可用于涂玻片、染色，接种于非选择性平板做次代培养。盖好孵育盒盖，放置几分钟，观察每个微量杯都应呈阴性反应的颜色。孵育盒放入30摄氏度温箱培养24小时。API 20NE试剂条接种要点（2）第26页，共32页。API 20NE 技术要点同化试验项目接种要求- 接种液面与杯口平齐，太多或不足会造成错误结果。第27页，共32页。API 20NE反应结果阅读要领（）一生化试验：不要打开塑料培养盒盖，先读取从GLU到PNPG的生化试验结果并记录之在NO3杯孔中按先后次序分别加入一滴NIT1和NIT2试剂，出现红色NO3为

13、阳性不出现红色时，加少许Zn粉，此时出现红色，则NO3为阴性，分钟内不出现红色，则NO3阳性TPR杯孔中加一滴James试剂，立即出现红色为阳性不出现红色为阴性二同化试验：从杯口上方往下看，红线模糊或菌悬液变浑浊，表明有菌生长，为阳性否则，为阴性偶有弱生长者可记录为或第28页，共32页。三在报告单上做出一个位数编码，查编码手册或API LAB软件四如果，查不到编码，或给出提示“IDENTIFICATION NOT VALID BEFORE 48-HR INCUBATION”,立即用液体石蜡将NO3和TRP封口继续培养小时,再读结果而NO3 和TRP要记录培养24小时的结果API 20NE反应结果阅读要领（）第29页，共32页。API STAPH-凝固酶阴性葡萄球菌于环境污染中常见-其中以金黃葡萄球菌为代表-以Kloos and Schleifer Classification为基础-试条由传统方法及发酵反应小管组成-22个条目(葡萄球菌及微球菌)第30页，共32页。API STAPH 技术要点(i)附加试验第21 - 溶葡萄球菌素 (lysostaphi