分子生物学课件RNA的生物合成

1、4-1 概述4-2 RNA聚合酶4-3 启动子4-4 终止子和终止因子4-5 RNA合成的调控4-6 转录后的加工第四章 RNA的生物合成4-1 概 述在由DNARNA蛋白质的信息流中，RNA是中心环节。 RNA是已知的兼具遗传信息和催化两种功能的大分子。 一、DNA与RNA分子的异同点（1）RNA核糖2位置有羟基，且以尿嘧啶代替胸腺嘧啶； （2）大部分RNA分子是单链的，这些RNA往返折叠使RNA具有比DNA更多结构上的多样性，使RNA具有各种不同的生物功能。二、DNA复制与RNA合成的异同点相同点：（1）除了某些病毒RNA基因组外，所有RNA分子都是以DNA为模板（模板使用）。 （2）合成

2、方向也是由53方向（极性）。（3）合成的化学机制基本相同，根据碱基互补配对。（4）都有起始、延伸、终止三个阶段。 不同点：（1）转录不需要引物。 （2）转录一般只涉及一个短的DNA序列片段；编码链（即非模板链、正链、有意义链），模板链（即负链、无意义链） （3）转录是由RNA聚合酶催化，与DNA上的特异序列启动子结合并开始转录（复制是由DNA聚合酶开始，从复制起始点开始）。 （4）RNA合成不象DNA有校对机制(Proof reading) 。 （5） 转录时，DNA双螺旋一段短距离范围解螺旋形成转录泡(Bubble)，RNA在形成后不久被剥离模板。Coding strand of DNA h

3、as the same sequence as mRNA.Transcription is catalyzed by RNA polymerase4-2 RNA聚合酶一、RNA聚合酶催化反应 RNA聚合酶是转录过程中的关键酶，原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成，但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。激活RNA聚合酶的活性需要DNA，它以双链DNA为模板时活性最强！ 4种NTPDNA指导的RNA聚合酶 DNA，Mg+或Mn+ RNA + ppiTranscription is catalyzed by RNA polymerase二、原核生物的RNA聚合酶加上亚基后则成为聚

4、合酶全酶（holoenzyme）相对分子量为4.65 105 。 E.coli的RNA聚合酶由五种亚基组成、 。2亚基组成核心酶；(一) 组成：亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合，催化磷酸二酯键形成。 （ 亚基为碱性蛋白质，与酸性DNA之间可借静电引力相结合； 亚基也可借疏水相互作用与DNA结合,它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性）、：由和亚基组成了聚合酶的催化中心。亚基：与核心酶的组装及启动子的识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。亚基：功能还不清楚。(二) 功能：它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。亚基：因子可以极大地提高R

5、NA聚合酶对启动区DNA序列的亲和力，其作用是负责模板链的选择和转录的起始。因子可使酶与底物结合常数提高103倍 ，时间可达数小时，还可以使酶与模板DNA上的非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底物复合无的半衰期小于1s。E.coli中RNA聚合酶50bp/s（37）；每个E.coli：细胞中约7000个 酶分子； 细菌的 m RNA、r RNA、t RNA、由同一种RNA聚合酶所转录。 在某些细菌细胞内含有能识别不同启动子的因子，以适应不同生长发育阶段的要求，调控不同基因转录的起始。在E.coli中最常见的调控因子是70，而32 是与热休克启动子所控制的基因转录密切相关，54 则参与细胞

6、的N代谢。Sigma factor is the subunit of bacterial RNA polymerase needed for initiation; is the major influence on selection of binding sites (promoters).（三）过程：三、真核生物的RNA聚合酶真核生物的基因组远比原核生物大，它们的RNA聚合酶也要复杂。真核生物的RNA聚合酶有三类，相对分子量都在5 105左右，通常有8-14个亚基，并含有Zn2+ 。Alpha-amanitin (双环八肽) isolated from Amanita phalloid

7、es （一）分类：RNA聚合酶 ：对-鹅膏蕈碱（ -amanitine ）不敏感；转录45s rRNA前体。RNA聚合酶 ：可被低浓度-鹅膏蕈碱（ 10-9-10-8 mol/L ）所抑制；转录所有编码蛋白质的基因和大多数核内小 RNA（snRNA）。RNA聚合酶：只被高浓度-鹅膏蕈碱（ 10-5-10-4 mol/L ）所抑制；转录小的RNA基因，tRNA、5S rRNA 、 U6 snRNA、scRNA。（二）组成： 将提纯的酵母RNA聚合酶进行凝胶电泳可分出10条明显的条带。最大的3个亚基分别相当于细菌RNA聚合酶、的同源物，化学计量测定它们之间的比例为2：1：1，它们担负着RNA聚合酶

8、的基本功能 。 *真核生物RNA聚合酶中没有细菌因子的对应物，因此必须借助各种转录因子才能选择和结合到启动子上。 转录过程与细菌不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能识别和结合到启动子上，而需要在启动子上由转录因子和RNA聚合酶装配成活性转录复合物才能起始转录。 （三）过程：真核生物的转录过程分为装配、起始、延伸和终止4个阶段，其间各种因子的作用比细菌的复杂得多。4-3 启动子（promoter）一、启动子的基本结构启动子：是指RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列。转录单元（transcriotion unit）：是一段从启动子开始至终止子（terminator）结束的DNA序列。转

9、录起点：是指新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription.转录上游（upstream）：常指起点前面5末端的序列； (用-1，-2，-3表示)转录下游（downstream）：常指起点后面3末端的序列；(用+1，+2，+3表示)换句话讲，从转录起点沿RNA聚合酶运动方向称为下游，而反方向为上游，在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3 ，上游方向依次为-

10、1、-2、-3 二、原核生物启动子的结构特点足迹分析法(footprint）足迹分析法是pribnow 设计的一个实验与DNA测序技术相结合。是确定启动子的序列结构的方法。 所谓足迹法既是将DNA起始转录的限制片段分离出来。加RNA聚合酶使之结合。再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不水解，其余部位水解成长短不同的片段，经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位。大肠杆菌RNA聚合酶在转录起始阶段缩短覆盖DNA的长度启动子共有序列的功能上游区有两个共有序列：Pribnow区：又称-10区（TATAAT），有助于DNA局部双链解开。35序列：又称识别区（TTGACA），提供了RNA聚合酶识别信号。

11、启动子结构是不对称的，它决定了转录的方向。三、真核生物启动子（一）分类：1. RNA聚合酶的启动子：核心启动子（-45+20）；上游控制元件（UCE，-180 -107 ）真核生物的启动子由转录因子识别，而不是RNA聚合酶所识别，多种转录因子和RNA聚合酶在起点上形成前起始复合物（preintiation complex）而促进转录。2. RNA聚合酶的启动子： 5S rRNA 和tRNA以及胞质小RNA（scRNA）基因的启动子位于转录起点下游，即基因内部。核内小RNA基因启动子在转录起点上游。3. RNA聚合酶的启动子class 启动子涉及众多编码蛋白质的基因表达控制。包括以下几类控制元件

12、：ModuleConsnesusDNA boundFactorTATA boxTATAAAA10bpTBPCAAT boxGGCCAATCT22bpCTF/NF1GC boxGGGCGG20bpSP1OctamerATTTGCAT20bpOct-1OctamerATTTGCAT23bpOct-2kBGGGACTTTCC10bpNF kBATFGTGACGT20bpATFTATA boxCAAT boxGC boxOctInrGoldberg-HegnessInr:位于转录起始点的起始子（initiator,Inr），可用同式Py2ANPy5表示之。TATA区:位于转录起始点上游-25 -30b

13、p处的共有序列TATAAA，也称为TATA区。CAAT区:起始点上游-70 -78bp处另一段共有序列GGCCAATCT，称为CAAT区。GC区:起始点上游-80 -110bp处含有GCCACACCC或GGGCGGG 序列，称为GC区。增强子:起始点上游-100bp以上处含有72bp长的重复序列，称为增强子（enhancer）。RNA聚合酶和转录因子在启动子上的装配4-4 终止子和终止因子一、基本概念终止子（terminator） ：模板DNA上存在终止转录的特殊信号 终止因子（termination factor）：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质），称为终止因子。 通读（re

14、adthrough）：有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称通读。 抗终止因子（antitermination factor）：这种引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。Terminator is a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription.二、终止子的种类所有原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产生的RNA可形成有茎、环构成的发夹结构。 （一）简单终止子（即不依赖于因

15、子的终止子） 1.终止子上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡结构； 2.在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产生的3端为寡聚U，可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。 终止子效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。（二）依赖于因子的终止子 依赖于因子的终止子必需在因子存在时才发生终止作用。 1. 依赖于因子的终止子其回文结构中不富含GC区； 2.回文结构之后也无寡聚U序列 .依赖于因子的终止子在细菌染色体中少见，而在噬菌体中广泛存在。 三、终止因子 1因子

16、： 它通过催化NTP的水解使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。 2.NusA蛋白 NusA蛋白是一种可以与RNA聚合酶结合的识别终止子的特殊辅助因子。（nus位点包括NusA NusB NusG等 ） NusA因子可以提高终止效率，可能是由于它能促进RNA聚合酶在终止位置上的停顿。NusA蛋白可以与RNA聚合酶的核心酶结合，形成2NusA复合物。 转录终止后，RNA聚合酶脱离模板，NusA又被因子所取代。 四、抗终止抗终止作用主要见于某些噬菌体的时序控制。前早期基因N 蛋白晚早期基因表达抗终止表达Q 蛋白抗终止晚期基因表达由于不同生理要求，在转录过程中有时即使遇到终止信号，

17、仍然需要继续转录，即为抗终止作用。（一）抗终止过程（通读）（二）抗终止作用主要有两种方式：1.破坏终止位点RNA的茎环结构 例如某些控制氨基酸的操纵子基因的转录受氨基酸浓度的高低控制。当浓度低时，破坏终止位点RNA的茎环结构，抗终止；当浓度正常时，mRNA形成正常的二级结构，其中包括末端的茎环结构，RNA正常转录。2.依赖于蛋白质因子的抗终止作用例如噬菌体中由N基因编码产生的N蛋白具有抗转录终止的作用。其功能的发挥依赖于寄主所产生的NusA 、 NusB、S10等几种蛋白质。 NusA因子由N蛋白的研究而得名，其为酸性多肽，可以与N蛋白结合，也可与RNA聚合酶结合，改变其构象，使之对终止子不敏

18、感。可见NusA对RNA聚合酶的转录速度和终止都有肯定的作用，说明它在调解因子之间起中介作用。 五、真核生物的转录终止信号 RNA聚合酶的转录产物是在3末端切断，然后腺苷酸化，并无明显的终止作用。 RNA聚合酶、 ，转录末端有一段连续的U，但不足以成为终止信号。很可能是与U前后的富含G、C序列及polyT是真核生物RNA聚合酶的转录终止信号。4-5 转录后的加工一、原核生物中RNA转录后的加工（post-transcriptional processing） 在原核生物中，rRNA、tRNA（部分）组成混合操纵子，某些tRNA簇与编码蛋白质的基因组成操纵子它们形成的多顺反子转录物，经断裂形成r

19、RNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。 （一）原核生物中rRNA转录后的加工RNase IIIRNaseERNase III是一种负责RNA加工的核酸内切酶，它的识别部位RNA为特定的RNA双螺旋区，切割产生16S rRNA、23S rRNA前体。 5S rRNA在RNaseE作用下产生原核生物rRNA含有多个甲基修饰成分，包括甲基碱基和甲基核糖 两端的多余附加序列需要进一步由核苷酸酶切除。 （二）原核生物中tRNA转录后的加工 1. 由核酸内切酶在tRNA两端切断：RNase P切5端，RNase F切3端。（二）原核生物中tRNA转录后的加工2. 由核酸外切酶进一步进行修剪，从前体3

20、端逐个切附加序列，直到tRNA 3 端。3. 在tRNA 3 端加上CCA-OH，此反应是由tRNA核苷酰转移酶催化进行，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸。 4. 核苷酸的修饰及异构化，包括甲基化和假尿嘧啶核苷。tRNA + S-腺苷蛋氨酸（SAM） 甲基- tRNA + S-腺苷高半光氨酸 RNase P是一种很特殊的酶，含有蛋白质和RNA两部分，在某些条件下，RNase P中的RNA（M1RNA）单独也能切断tRNA前体的5端序列。二 真核生物中RNA转录后的加工hnRNA链长约是mRNA的45倍。 )含有内含子序列的最初转录物，即mRNA前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间物，

21、被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA） (一)hnRNA的加工1. hnRNA对哺乳动物来说大约有25%的hnRNA经加工转变成mRNA 。 . hnRNA的加工过程（1）5端形成特殊的帽子结构（ m7G5pppNmpNp_）（2）3端的产生和多聚腺苷酸化（3）mRNA的内部甲基化（4）通过拼接出去内含子转录序列（1）5端形成特殊的帽子结构（ m7G5pppNmpNp_）pppN1pN2pRNA RNA三磷酸酶ppN1pN2pRNA + pi ppN1pN2pRNA mRNA鸟苷酰转移酶 +ppi G5pppN1pN2pRNA +GTP G5

22、pppN1pN2pRNA +SAM m7G5pppN1pN2pRNA mRNA甲基转移酶 +S-腺苷高半光氨酸 m7G5pppN1pN2pRNA +SAM 甲基转移酶 m7G5pppNmpN2p-RNA +S-腺苷高半光氨酸 （2）3端的产生和多聚腺苷酸化高等真核生物细胞和病毒mRNA在靠近3端都有一段保守序列AAUAAA，这一段序列为链的切断和多聚腺苷酸化提供了某种信号。 PolyA由多聚腺苷酸聚合酶所催化。 RNA为受体，ATP为供体，需要Mg2+或Mn2+及蛋白质参与作用。 PolyA尾巴可能起到缓冲作用，防止核酸外切酶对hnRNA信息序列的降解作用。 （3）mRNA的内部甲基化主要m6

23、A（N6-甲基腺嘌呤），它可能对mRNA前体的加工起识别作用。 （4）通过拼接出去内含子转录序列大多数真核基因为断裂基因，其转录产物需要拼接，去内含子序列，使编码区成为连续序列。 三、RNA的拼接（splicing） （一）RNA拼接的4种方式（分子内）类型I的自我拼接（group I self-splicing）类型II的自我拼接（group II self-splicing）hnRNA的拼接tRNA的拼接1.类型I的自我拼接（group I self-splicing） 1981年，Cech在研究四膜虫rRNA前体拼接过程中发现的。它可以自我催化完成。 此拼接只需1+、2+阳离子以及鸟苷酸

24、（或鸟苷）存在即可自发进行，无需能量及蛋白酶的催化，实际是磷酸酯的转移反应。类型I的自我拼接的内含子分布广泛，出现在线粒体、叶绿体编码的rRNA、tRNA、 mRNA的基因中；低等真核生物的rRNA基因。 .类型II的自我拼接（group II self-splicing）类型II内含子本身也具有催化功能，能够自我完成拼接。 经过两次转酯，内含子成为套索（lariat）结构被切除，两个外显子可以连接在一起。 转酯反应无需游离的鸟苷酸发动，而是由内含子靠3末端的腺苷酸2-OH攻击5端磷酸基引发的。 类型II内含子只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体中。 核mRNA的（hnRNA）拼接体的拼接（nuc

25、lear mRNA spliceosomal） 真核生物的mRNA初始转录物中发现的第三类内含子也是最大的一类的内含子。通过同样的套索机制进行剪接，剪接需要特殊的RNA-蛋白质复合物的作用。 GT-AG规则 ：这类内含子的左端（5端）均为GT，右端（3端）均为AG（对应于RNA为GU-AG） 拼接体（spliceosome）：在被拼接的RNA上，由上述5种U系列snRNA （U1、U2、U4、 U5、U6）和约50种蛋白质所组成的复合物（5060S），呈有突起的椭球体。 核内tRNA前体的酶促拼接 酵母tRNA前体的拼接需要ATP和一个内切核酸酶。 反应分为两步进行：（1）由一个特殊的核酸内切

26、酶断裂磷酸二酯键，切除插入序列，反应不需要ATP。 （2）由RNA连接酶催化使切开的tRNA两部分共价连接。反应需要ATP（植物、酵母类）。 生物体存在分子间的拼接，即反式拼接。（二）反式拼接与选择拼接（trans-splicing and alternative-splicing） 1. 反式拼接（trans-splicing） 如果一个分子具有5拼接点，另一个分子具有3拼接点，它们又靠得很近，就可以发生反式拼接（如锥虫的众多mRNA）。 一个基因的转录物在不同的发育阶段，分化细胞和生理状态下，通过不同的拼接方式，可以得到不同的mRNA和翻译产物，称为选择性拼接。所产生的多种蛋白质即为同源体

27、（isoform）。2.选择拼接（alternative splicing）现以降钙素的mRNA前体为例，说明选择拼接的机制。 （三） RNA拼接的生物学意义1.RNA拼接是生物机体的进化历史形成的，是进化的结果。3.从内含子的拼接方式和分布可以大致推测其起源时间。2.RNA拼接是基因表达调控的重要环节。4.拼接促进有益重组，对生物机体进化十分重要。5.内含子和外显子是相对的，有些内含子可以编码序列，能够产生蛋白质或功能RNA，不能将内含子看成是无用序列，因此，拼接过程是必要的。 四、RNA的编辑（RNA editing）是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，这种改变mRNA编码序列的方式，叫RNA的编辑。经过编辑的mRNA序