原代培养中成纤维细胞的抑制

1、成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维 细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面 呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个 长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈 本类形态生长。培养细胞的纯化【我是小米2】培养细胞的纯化：1、自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后 留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯 化建立细胞系。2、人工纯化（1）酶消化法在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相

2、当长的时间才 脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异 采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。（2）机械划除法原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂 生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此 可以采用机械的方法去除不需要的细胞。（3）反复贴壁法成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约 10-30m h完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定, 稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。（4）克隆法采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长

3、成克隆，选择出所需要的克 隆。（5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用 这种技术来纯化细胞。（6）流式分选brdusxtyzyq2除了 Bidu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的snany阿糖抱昔效果不是特别理想【C11202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大 量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞 而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的 生长，先加入含有胎牛血清（100m 0）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去 成纤维细胞，然后再换用无血清

4、的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。sxtyzyq2 买s总m a公司的bidu然后把它配成终浓度为1mm 然后Im 1 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞gfeng8078我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5%rdu 用多大的浓度？cheerfiihess养心肌原代 最初24h培养液中加入终浓度为0.1m m oPL的 brdugfeng8078】你是怎么样达到0.1m m oPL的浓度呀，由于有培养液的存在,加 了 Bidu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可 是有报道说这对Bidu的药效有影响jhngbhl230请问用组织块贴壁法

5、能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多 次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于 正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少？我养的是内皮细胞，如何 时差帖壁啊？vrtoh不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一 样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复 杂了上皮细胞warn bull我现在正在做的培养，但发现有儿瓶细胞可能是被成纤维细胞（长 梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在乂 出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞

6、？还有，我养的色 素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？【叶知秋】上皮细胞传代次数多后，其形态就类似成纤维细胞，你也可以爬片作 细胞鉴定，了解有无污染情况。生长缓慢除提高血清浓度外，还可以增加换液次 数，及时分瓶传代。yhdy2001】你可以试着用高糖培养基，这样细胞增殖快，目前国外和国内较 大的细胞研究所普遍采用高糖培养基；另外，做原代时取材很关键，尽量避免筋 膜等组织的污染pipig曾经看过一篇论著，具体名字记不清了，里面从分子和蛋白水平论证 了视网膜色素上皮细胞传代4代以后基本没有RPE原有性质特征，只具有成纤 维细胞的特征。qkkl229同意N代后就是成纤维细胞的

7、模样，很多细胞体外培养到后来，都 长的象成纤维细胞，不知道为什么，有人知道吗？jhm esxia去除成纤维细胞1、反复贴壁法（差速贴壁法）：倒去旧培养液，用Hanks液洗3次，然后加 入消化液（0.2% EDTA+0.25%胰蛋白酶），37C10m h,镜下可见成纤维细胞 成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加Hanks液吹打细胞使成纤维细胞脱 落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hanks液轻轻漂洗3次。加入培养液C02 孵箱，37C,每周换液1次，处理1次。2、血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较 差，利用这个差异，用含1.5%血清的培养液可以降低培养物中成纤维细

8、胞的生 长。垂体细胞ccyy30我在胚胎大鼠腺垂体细胞的原代培养中发现有好多的成纤维细胞和 神经细胞，如何纯化【hoyangu】原代培养中要除去较多的成纤维细胞，在接种 细胞于膜插片前，按15 * 1 0的5次方个/ m 1的细胞密度接种到大约5m 1单 个细胞悬液到2 5立方厘米培养瓶中，原代培养2天后，不经胰酶消化，通过吹 打收获漂浮的细胞和被分散的细胞，离心（15 0 0转/分，1 0分钟），再用 培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液，然后接种在膜插片上，这样可以除去黏 附的成纤维细胞而保留要的细胞.ccyy30这种方法是否就是差速贴壁法，膜插片指的是多聚赖氨酸包被培养 板吗星形胶质细胞g

9、aowefi8755我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需 要注意两方面：1,取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑 组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2,差速贴壁法， 可以将细胞先差速贴壁2030分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接 种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可 心肌细胞gm wangl991心肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去心肌细胞中混杂 的成纤维细胞和内皮细胞就是利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁快而心肌细胞贴 壁慢的原理进行换皿法来纯化心肌细胞的。换皿后最好48小时内对你所培养的 心肌细胞不

10、进行任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。如果还是不能够贴 壁的话，你可以考虑一下用塑料瓶，或者对培养用的玻璃瓶进行如下处理：在培 养前进行鼠尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋白包被，在这方面有许多文献 报道的，你只需要注意看都会有解决办法的。猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶 中培养广2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24 孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌 通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。whdboy77】乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，

11、培养过程较为繁琐。文献上有 多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较 小，比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时 间较长，所以我们乂采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管 抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的 不同，采用差速贴壁lh,除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体 呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和 心肌细胞鉴别。胰岛细胞genobody大鼠胰岛细胞原代培养一周龄W Blar大鼠，断颈处死，于75弦乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于

12、冰冷无菌D4ianks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织， 转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.14.0mm 3大 小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D blanks液反 复清洗810次，加入10倍体积无菌消化酶液|腹蛋白酶戒原酶消化液：0.05g 胰蛋白酶(Sim a), 0.025g V型胶原酶(Sima, 663U/fng), 0.05g葡萄糖，溶 于 100 m L 无Ca2+、Mg2+ 的 0.01m oLLPBS (pH 值为 7.4)溶液,用 0.22pm 微孔滤膜滤菌,38CdioC消化，消化过程中不断震荡，1

13、0分钟后吸出上面酶液 弃去，用无菌D4ianks液将组织块清洗厂3次，加入新鲜酶液继续消化，重复 上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38CiC消化 10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化； 而原消化酶液1500ipm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D4ianks悬浮，离心，重复广2次，再用培养基洗厂3次，用培养基悬浮即得 细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5、6次至组织块消化完全，重复以上操 作，合并儿次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2X05个细胞而L,将细胞 悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔ImL,置于37C, 5%C

14、0 2,饱和湿度培 养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振 荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将 新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng而L的碘乙酸的培养 基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙 酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37C, 5% C0 2,饱和湿度培养 箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，w angtsy胰岛的分离与纯化取新生1书天SD大鼠10-15无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4C Hanks液清洗三次后，用眼

15、科剪反复剪切至 0.5m m 3组织块，取浓度为lg/L的V型胶原酶溶液540m 1与之混合，转入三角 烧瓶中，于37C恒温水浴振荡器消化3020m in,加入两倍体积4CHanks液 终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800ipm低速离心70s去 上清液，并用4C Hanks液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加 入含2.5m g/L碘乙酸的PRM H640完全培养基（含10%胎牛血清、10m m ol/L HEPES缓冲液、1mm oil丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100m g/L链霉 素、71.5umol/L0嗷基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75m 1玻璃

16、培养瓶中，于 37C,5% C0 2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次， 以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h,转瓶弃去贴壁细胞，用无 血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMH640完全培 养基养吧，可长成胰岛单层细胞。内皮细胞benn看到园子里有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞，我也在做内皮细胞培 养，现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法，正在摸索中，说出来与大 家讨论.材料与方法：材料：培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。眼科剪、眼科镣、手术刀片。3.5% C02 孵箱、PH 计。恒温水浴箱。RPM H640培养基，D+la

17、nks缓冲液、胎牛血清,内皮生长因子（ECGF）, 青霉素，链霉素，戊巴比妥钠等。方法：取材：46wW i s t a r大鼠，大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后 的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动 脉，用2m 1注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入Dtanks液，驱除残血,取主动 脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60C预热无菌水中2秒。然后置于准 备好的RPM H640培养基（含双抗）中。剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中，用眼科镣小心剥离外膜面的结缔组 织，并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍，去除残血后，将动脉转移 至另一含少量培基的无

18、菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去，剩下的主动脉 切成宽的环。接种：将动脉环竖直放入35mm培养1111（1%明胶4C预置过夜，用前2 h移入C 02培养箱，用前培养液冲洗）中。置C02培养箱2 h后，加入1.5ml培养基。放 入37C,5% C 02培养箱中培养。72 h后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细 胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后，可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有 明显的无细胞区界限，用玻璃针剔除成纤维细胞，得到纯的内皮细胞生长克隆。 继续培养1015 d ,此时FBS浓度为2 0 %，形成细胞单层。置于5% C02孵箱中培养，每隔3天换液，培养时添加15% FBS,510pig/ml 的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100pg/ml的肝素。待细胞90% 95%融合 时