园艺植物生物技术(理论课教案)-河南科技学院汉语

1、Biotechnology of Horticultural Plant园艺植物生物技术理论课教案河南科技学院园艺林学学院2021河南科技学院教案首页 授课时间 2021年3-7月 教案编写时间 2021年7月 课程名称园艺植物生物技术课程编号1306102040总学时 64讲课： 40 学时实验： 24 学时实习： 0学时学 分 数4课型必修课 选修课 理论课 实验课 任课教师李桂荣、杜晓华、姜立娜职称教授博士、副教授博士、副教授博士授课对象2021班级 园艺 专业 1、2班根本教材或主要参考书园艺植物生物技术，巩振辉主编 科学出版社 2021H.S.乔拉 植物生物技术导论(影印本) 科学出

2、版社 2004H.S.乔拉 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社 2005园艺植物生物技术，邓秀新、胡春根主编。高等教育出版社 2005教学目的与要求本课程的任务是使学生了解现代生物技术的开展概况和趋势，掌握园艺植物的组织培养根本技术、脱毒快繁技术、细胞培养和体细胞杂交技术、基因别离及遗传转化的根本原理和技术，以及DNA标记技术，为将来从事园艺植物生物技术相关研究及其产业应用奠定良好的理论和技术根底。教学重点、难点重点：生物技术的概念/应用现状、组织培养技术、病毒病脱除与无病毒繁殖难点：原生质体操作技术、基因别离克隆、转基因技术教学进程第 次课12-45-78-101112-1

3、314-171819-20授课章节40学时 Theory part40 hs1) Introduction2) Tissue culture of horticulture plant3) 园艺植物脱毒与离体快繁技术4)园艺植物细胞工程5)园艺植物染色体工程6)植物基因工程的根底知识与技术7)园艺植物基因的别离、克隆与遗传转化8)转基因技术在园艺植物育种上的应用9) 园艺植物的分子标记学 时266624824备 注本课程采用多媒体课件教学4次实验课，分别为园艺植物组织培养技术10学时、园艺植物染色体工程4学时、DNA鉴定及分子标记技术10学时。河南科技学院教案课时备课 第 1 次课 2 学时章

4、节第一章 绪论主要参考资料1巩振辉主编，园艺植物生物技术，科学出版社，20212，植物生物技术导论(影印本)，科学出版社，20043，植物生物技术导论(许亦农 麻密 译)，化学工业出版社，20054邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，2005教学目的和要求1掌握园艺植物生物技术的概念、内容、园艺植物生物技术的应用2熟悉园艺植物生物技术的开展历程3了解园艺植物生物技术的开展历程重 点难 点1重点：生物技术的内涵2难点：生物技术的实际操作教学内容一、生物技术的概念1.以现代生物学理论为根底，以基因工程为核心的一系列技术的总称。2.狭义的植物生物技术：在离体条件下，对植物细胞进行遗

5、传改进或使其增殖的各种技术的总称，包括细胞水平、分子水平两个大的层面。“Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make, or modify products or processes for specific use.二、生物技术类型三、生物技术的主要内容四、园艺植物生物技术的开展简史一组织和细胞培养是园艺植物生物技术的平台 1838-1839年，Schleiden和Schuwann

6、提出植物和动物均由细胞构成，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体的“细胞学说；同时指出，假设提供的条件同在活体内一样，每个细胞应该能独立生存和开展。1898年德国植物生理学家Haberlandt试图通过实验证明该学说，于1902年发表了植物细胞培养方面的第一篇论文，提出了植物细胞全能性Totipotency的概念。这一概念是指植物的每一个细胞在一定条件下，具有发育成一棵完整植株的能力。这一概念直到1971年烟草单细胞培养成功才得到完全证明并成为理论。1943年，White出版了?植物组织培养手册?。1958年，Steward从烟草髓细胞培养出完整植株，向证明细胞全能性迈进了一大步。该结果促进了多

7、细胞组织和器官的培养研究与应用。1960年Morel培养兰花茎尖获得再生植株，并证明脱除了病毒。该结果催生了兰花工业的开展。直到今天，世界兰花种苗根本上通过组织培养生产。同年，Cocking通过酶解法从植物组织中别离得到去除了细胞壁的原生质体，使组织培养技术又向前迈进了一步。 1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草快速生长的培养基配方，即今天十分流行的MS培养基。 1964年，Guha和Maheshwari成功地从蔓陀萝花药培养得到再生植株，开创了花药培养获得单倍体的先河。 1971年，Takebe等报道了烟草原生质体培养成为完整植株，至此，植物细胞全能性得到完全证明。次年，

8、Carlson获得烟草两个种间的原生质体融合再生的体细胞杂种植株。 植株组织培养的开展得益于两个方面的进展。一是对植物激素(plant hormone)的认识，以及人工合成激素生长调节剂，plant growth regulator，PGR的生产和应用，促进了植物组织培养技术的开展。1934年Went发现了植物生长素；1956年Miller发现细胞冲动素。正是这些发现带动了植物组织培养技术的开展。今天，组织培养研究多数情况下是在摸索激素配比，也说明了植物激素研究对组织培养的重要性。二是植物营养学科的开展。人们认识了植物生长必须的营养物质，利用该学科的成就，不断改进培养基配方，使得组织培养技术得

9、到迅速普及。植物组织培养技术的开展和成熟，有了一个离体无菌的技术平台，人们才有可能进行今天的转基因研究，才会有今天依赖离体培养的诸多技术的产生，如快繁技术，离体保存、茎尖微芽嫁接脱除病毒技术等。可以说，组织培养技术是植物生物技术的根本平台，一个作物组织培养技术的成熟程度可以影响其基因工程的进展。二基因工程技术是未来园艺植物生物技术的核心基因工程技术的开展以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志。人们把1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，作为分子生物学和基因工程技术的里程碑。与组织培养技术的开展历程类似，基因工程技术的开展得益于生物化学、遗传学、细胞学等多个学科的开

10、展。1983年，世界上首批转基因烟草和马铃薯问世；1986年，首批转基因植物进入田间实验；1993年，转基因番茄在美国面市。尽管转基因番茄没有在美国得到大面积推广应用，但转抗除草剂的大豆、转抗虫基因的玉米在美国等国家大面积推广，产品已销往世界许多国家。五、园艺植物生物技术的展望1. 脱毒与快繁技术广泛用于园艺作物种苗的生产2. 花药培养以及小孢子培养是获得单倍体以及纯合二倍体材料的最正确途径3. 胚抢救技术克服了果树早熟品种选育的技术难题4. 细胞融合技术创造出200多例柑橘体细胞杂种5.分子标记广泛应用于育种和资源研究6.基因克隆与遗传转化方兴未艾作业布置1.生物技术包括哪些内容？课后自我总

11、结分析绪论应讲得宏观一些，主要激发同学们对该课程和专业的学习兴趣。河南科技学院教案课时备课 第 2-4 次课 6学时章节第二章 园艺植物组织培养的理论根底与根本技术主要参考资料1巩振辉、申书兴主编，植物组织培养，化学工业出版社，20072雷特迪亚、克里斯蒂森，生物技术导论，科学出版社，20023李浚明、朱登云编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，20214邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，20055郭仰东主编，植物细胞组织培养实验教程，中国农业大学出版社，20216胡桂兵主编，园艺植物生物技术实验指导，中国农业出版社，2021教学目的和要求1掌握植物组织培养

12、的原理与技术2了解植物组织培养技术在园艺生产与品种改进中的应用现状与前景重 点难 点1重点：掌握植物组织培养操作技术2难点：组织培养技术的无菌操作教学内容第一节 概述一、园艺植物组织培养的概念和类型一根本概念组织培养二园艺植物组织培养类型1.培养材料2.培养基3.培养方式二、园艺植物组织培养的理论根底Basis for cell culture1.细胞是生物有机体的根本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。2.细胞分化和形态建成1合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；2体细胞生长类似，开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，

13、首先要经过去分化脱分化的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，而产生完整植株。体细胞胚胎发生胚状体可从以下几种培养物中产生：直接从器官上发生；从愈伤组织上发生；从游离的单细胞发生；从小孢子发生。3.最常见的再分化是根的形成：3 种方式先形成根的，往往抑制芽的形成；先形成芽的，较易产生根；同时产生芽和根。三、园艺植物组织培养的意义1.加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。2.服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。3.获得三倍体。4.快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。5.获得无病毒苗

14、木。6.离体保存包括超低温种质资源四、园艺植物组织培养理论与技术开展简史1. 探索阶段1902年，植物生理学家德，根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性totipotency的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，开展成完全植株的潜在能力。2. 奠基阶段3. 迅速开展阶段第二节 园艺植物组织培养所需的仪器及设备一、实验室设置一根本实验室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，枯燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。

15、培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持枯燥和清洁。二辅助实验室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、枯燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 二、培养容器与用具玻璃容器塑料容器金属用具塑料用具第三节 组织培养基一、培养基的种类和成分一培养基的种类1培养基是组织培养最重要的基质。2培养基

16、的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。3国际上常用的五种培养基：MS：Murashige 和Skoog (1962)ER：Eriksson1965B5：Gamborg等1968SH：Shenk和Hildebrandt1972HE：Heller1953MSMurashige和Skoog 1962M6朱至清1975：用于禾本科植物花药组织培养Miller1963：一般组织培养HBowgin和Nitsch：一般组织培养T一般组织培养White1963：一般组织培养B5Gamborg et al 1968一般组织培养C17王培等1986：小麦花药培养W14欧阳俊闻等1988：小麦花药培养KM8PK

17、ao et al 1975：原生质体培养Lloyd and MccounLloyd 1980：木本植物培养RMReinent et al 1967：兰花4各培养基特点MS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。ER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。SH：与B5相似，无机盐的含量稍高。HE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。(二) 培养基成分主要为五大类：一水二无机盐 大量元素 微量元素三有机化合物1碳水化合物2植物激素3. 维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸、一般0.5 mg/L。4肌醇：一般用量10

18、0 mg/L5氨基酸四天然复合物1椰乳 coconut milk2香蕉3水解酪蛋白1主要成分为氨基酸，浓度100200 mg/L。2受酶和酸的作用易分解。4马铃薯1去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200 mg/L。2对pH缓冲作用大。5其它1酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。2遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。五培养材料的支持物1琼脂agar)1凝固剂，一般1%.2为防止有害物质毒害，可加110 g/L的活性炭。2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。六抗生物质防止内生菌，可加抗生物质。二、培养基的制备一母液配制和保存二配制过程三pH值的调节四培养基分注：趁

19、热分注五灭菌和洗涤三、生长调节物质的应用一生长素1吲哚乙酸IAA：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2萘乙酸NAA：可人工大量生产，高温高压下稳定，功能比IAA高倍。32,4-D：可促进愈伤组织形成。不同器官对生长素的反响根：对生长素最敏感，低浓度下105103PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。二赤霉素GA31GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2GA3有刺激器官生长

20、的作用，但抑制器官的发生。3GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。三细胞分裂素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用。生长调节物质的使用溶剂1水中直接溶解困难。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等那么可用1 N的HCl溶解，再加水。2也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一般用mg/L表示。使用量1一般生长为10 mg/l。细胞分裂素20 mg/l 。2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。生长素/细胞分裂素

21、 低 促进芽形成生长素/细胞分裂素 高 促进根形成第四节 组织培养技术一、Steps of MicropropagationStage 0 Selection & preparation of the mother plantsterilization of the plant tissue takes placeStage I - Initiation of cultureexplant placed into growth mediaStage II - Multiplicationexplant transferred to shoot media; shoots can be cons

22、tantly dividedStage III - Rootingexplant transferred to root mediaStage IV - Transfer to soilexplant returned to soil; hardened off二、外植体灭菌1.过程2.材料与前处理3.灭菌消毒 药剂种类与消毒处理时间三、组织培养过程中的变异现象一现象Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by

23、a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered.The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related s

24、pecies, or in an unrelated organismTotal sources of variation: Mutation, Hybridization, PolyploidySomaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phaseThere are two general types of Somaclonal Variation:Heritable, genetic changes (alter the DNA)St

25、able, but non-heritable changes (alter gene expression, AKA epigenetic)Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail Inducing MutationsPhysical Mutagens (irradiation)Neutrons, Alpha raysDensely ionizing (“Cannon balls), most

26、ly chromosome aberrationsGamma, Beta, X-raysSparsely ionizing (“Bullets), chromosome aberrations & point mutationsUV radiationNon-ionizing, cause point mutations (if any), low penetratingChemical Mutagens (carcinogens)Many different chemicalsMost are highly toxic, usually result in point mutations二组

27、织培养过程变异的利弊与利用AdvantagesScreen very high populations (cell based)Can apply selection to single cellsDisadvantagesMany mutations are non-heritableRequires dominant mutation (or double recessive mutation); most mutations are recessiveCan avoid this constraint by not applying selection pressure in cultu

28、re, but you loose the advantage of high through-put screening have to grow out all regenerated plants, produce seed, and evaluate the M2Alternative: perform on haploid cell linesDisease Resistant Success using Somaclonal Variation作业布置1.概念：组织培养、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体保存等。2.简述组织培养室的根本设施，画图描述。3.简述培养基配制的根

29、本流程、应注意哪些方面。4.简述组织培养技术主要有哪些应用。课后自我总结分析该章是本课程的重点，是同学们毕业后可以应用的最根底技术；除技术外，同学们对根本建立起一个组培实验室也很有兴趣。河南科技学院教案课时备课 第 5-7 次课 6 学时课目、课题章节第三章 园艺植物脱毒与离体快繁技术主要参考资料1巩振辉、申书兴主编，植物组织培养，化学工业出版社，20072雷特迪亚、克里斯蒂森，生物技术导论，科学出版社，20023李浚明、朱登云编译，植物组织培养教程(第3版)，中国农业大学出版社，20214邓秀新、胡春根主编，园艺植物生物技术，高等教育出版社，20055郭仰东主编，植物细胞组织培养实验教程，中

30、国农业大学出版社，2021教学目的和要求1了解园艺生产中存在的病毒病类型与脱除的原理2掌握病毒脱除技术与检测方法3掌握园艺植物离体快繁操作技术及代表性园艺植物快繁操作技术4了解人工种子操作技术及应用重 点难 点1病毒病的类型；2病毒病脱除技术与检测方法3代表性园艺植物离体快繁操作技术教学内容园艺植物的脱毒 detoxification of horticultural plants脱毒的意义The significance of seedling病毒的定义：是一类没有细胞核、细胞质和细胞壁结构，但有遗传复制等生命特征，主要由核酸和蛋白质组成的大分子生物。病毒个体相当微小，大多数病毒在10030

31、0毫微米之间。 virus definition: is a kind of have no nuclei, cytoplasm and cell wall structure, but has the vital signs, such as genetic replication is mainly composed of a nucleic acid and protein molecules. Relatively tiny virus individual, most of the virus between 100 300 nm 病毒是结构简单的微小生命体，病毒粒体有各种不同形状，

32、由一种核酸RNA或DNA和外面的蛋白质或脂蛋白质衣壳所组成，并且在适宜的条件下至少可以在一种寄主上引起病害。Tiny organisms is simple in structure, virus, the virus granule has a variety of different shapes, by a kind of nucleic acid (RNA or DNA) and proteins (or lipoprotein) outside of capsid, and under the condition of suitable at least can cause dise

33、ase in a host.病毒是传染性寄生物，它的核酸基因组的重量小于3108道尔顿，需要有寄主细胞中的核糖体和其它成分才能增殖。the virus was infectious parasites, the weight of the nucleic acid genome is less than 3 x 108 Dalton, needs a ribosome in host cells and other components to proliferation园艺植物病毒病的侵染特性：与真菌和细菌病害不同，病毒多为系统性侵染systemic infection，即病毒侵染后很快扩展至

34、植物的全身，因此，从带有病毒的植株上取接穗或插条繁育的苗木，也带有病毒。horticultural plant virus disease infection characteristics: unlike fungal and bacterial diseases, virus of systemic infection (systemic infection), the virus quickly extended to plant after the whole body, therefore, from the plants with a virus or cutting scion

35、nursery stock breeding, also with a virus.潜伏侵染latent infection，这类病毒称为潜隐病毒latent virus。 Latent infection (latent infection), this type of virus called latent viruses (latent virus get). 脱毒的方法The method of seedling茎尖培养脱毒Stem tip seedling cultivationWhite1943年首先发现了感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒浓度很低；1. The White

36、(1943) first discovered near the tobacco plant growing point of tobacco Mosaic virus infection virus concentration is very low;2Morel等1953从感染花叶病毒的大丽菊别离出了茎尖分和组织，并得到无病毒植株。2. Morel etc. (1953) from the Mosaic virus infection dahlia chrysanthemum is isolated from the stem tip points and organization, an

37、d to get virus-free plants.3以后，相继在其它植物培养成功，如：马铃薯、菊花、兰花、百合、草莓、矮牵牛、茑尾；3. Later, successively develop successfully in other plants, such as: potatoes, chrysanthemum, orchid, lily, strawberries, petunias, iris;二微体嫁接脱毒(2) microbody seedling grafting培养无病毒植株解决生根难的问题茎尖嫁接苗无童期的，能快开花结果。从1980年开始，农业部在河南科技学院建立了柑橘

38、研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙无病毒良种生产程序，率先在我国进行柑橘茎尖微芽嫁接及无病毒良种繁育技术研究，该工程1986年获农业部科技进步二等奖。此后后，河南科技学院柑橘研究所为全国柑橘主产区培养了大批技术骨干。1988至1991我所与广西农垦局横向联合，培育了12个优良柑橘品种脱毒苗200余株，为广西省无病毒柑橘推广起到了良好的示范作用。茎尖嫁接脱毒的原理茎尖微芽嫁接脱毒：根据一般病毒在植物体内分布不均匀，顶端生长点的分生组织不带毒或检查不到病毒的原理，通过茎尖嫁接脱毒得到无毒苗。目前茎尖嫁接方法可脱去柑桔大多数病害，这一方法被世界各国普遍采用，成为获得柑桔良种无毒植株的主要手段。

39、操作方法：试管砧木苗的培养；茎尖消毒和嫁接；移栽试验病毒鉴定Cultivate virus-free plants root difficult problems stem tip grafting without children period, can quickly bear fruit., beginning in 1980, established the citrus research institute, the ministry of agriculture in henan institute of science and technology, professor in Z

40、hangWenCai under the auspices of modeled after the Spanish no virus seeds production program, take the lead in China in citrus stem tip micro bud grafting and no virus well-bred breeding technology research, science and technology progress prize of the ministry of agriculture for the project 1986. S

41、ince then, citrus research institute of henan institute of science and technology for national citrus producing has trained a large number of technical backbone. Between 1988 and 1991 I and guangxi bor transverse joint, developed 12 varieties of citrus virus-free 200 strains, in guangxi province, no

42、 virus citrus promotion has played a good demonstration effect.The principle of stem tip seedling graftingStem tip micro seedling bud grafting: according to the general virus in the uneven distribution of plants, growing point at the top of the meristem without toxic or check virus principle, non-to

43、xic is obtained by seedling stem tip grafting seedlings., the stem tip grafting method can remove most of citrus diseases and this method has been widely used around the world, become the main means of citrus thoroughbred non-toxic plantsOperation method: in vitro root stock seedling cultivation; St

44、em tip disinfection and grafting; Transplanting test Virus identification三热处理脱毒通常，热处理对球状、线状病毒、类菌质体、类细菌体是有效的。对类病毒没有效果。(3) heat treatment course, usually, the heat treatment for spherical, linear virus, bacterial plasmids and bacterial is effective. The virus has no effect.四其它脱毒方法1愈伤组织培养无病毒苗：取材方便，一次可得

45、到大量无病毒苗；2茎尖微体嫁接培养：桃、柑桔、苹果等，砧木试管培养，然后嫁接无病芽；3珠心胚培养：柑桔类，通过珠心细胞产生无性胚珠心胚，培养可以得到无病毒的珠心胚苗。4) other detoxification method1. The callus culture virus-free seedling: conveniently, one can get a lot of virus-free seedling;2. Stem tip microbody grafting cultivation: peach, citrus, apple, etc., the scion in vitr

46、o, and then grafted disease-free bud;3. The nucellus embryo culture: citrus, asexual embryo by nucellus cells (nucellus embryo), culture can get no virus nucellus embryo seedlings.4. Anther culture obtain virus-free seedling三、脱毒苗的鉴定一脱毒效果的检测1草本植物：汁液摩擦法，从待检植株上取一定的组织，包括叶片、花瓣、根、或枝皮，参加25倍V/W的提取缓冲液，在低温条件下

47、研磨，然后蘸取汁液在撒有金刚砂的供试指示植物叶片上轻轻摩擦，接种完毕立即用蒸馏水冲洗净叶片上残留的汁液。然后将指示植物放在2228、半遮荫的条件下生长，定期观察并记录指示植物的病症反响。 2木本植物：汁液磨擦接种；.嫁接接种3.血清学检测 抗原antigen：凡注射到动物体内能刺冲动物机体产生免疫反响的物质均可称为抗原。抗原刺冲动物机体发生免疫反响而产生抗体的特性叫免疫原性；抗原能与所产生的抗体发生特异性结合，这种特性叫反响原性；抗原性 上述二者合称。兼具这两种特性的抗原物质称为完全抗原；只有反响原性，没有免疫原性的抗原物质称为半抗原。植物病毒抗血清制备 (1) 病毒抗原的别离纯化与制备 从感

48、染病毒的寄主植物中，通过物理和化学的方法，将病毒与寄主植物的各种组分别离，以获得纯洁的病毒制品。 病毒抗原的制备方法，主要步骤包括分步沉淀、差速离心和梯度离心等,去杂质浓缩病毒。植物病毒抗体制备1植物病毒抗血清制备 用纯化的病毒抗原免疫注射动物获得。常用动物为家兔，一般选用半周岁左右、体重23千克、健康、自然抗体阴性的日本大耳兔和半耳垂家兔.以上方法制备的抗血清含有多种抗体，这些抗体是由动物的多种淋巴细胞所产生的，因此也称为多克隆抗体Polyclonal antibody，Pab(2) 单克隆抗体 单克隆Monoclone即是单一的无性细胞系，或称单细胞系。单克隆抗体就是由免疫动物的单细胞系所

49、产生的抗体。 常用血清学检测方法 1)免疫电镜技术Immunoelectron microscopy，IEM是将抗原与抗体的专化性免疫反响与电镜观察相结合的一种病毒检测方法。其操作简便、结果判断直观。 抗原吸附免疫修饰染色透射电镜观察 (2) 酶联免疫吸附分析Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，ELISA 具有检测灵敏度高、快速、简便、准确等优点，不需要提纯病毒，可在较短时间内检测大量样品。 直接法即所用酶标抗体为病毒特异抗体，因此针对不同抗体需分别进行标记；间接法所用酶标抗体为通用的市售抗体，如：羊抗兔酶标抗体、羊抗鼠酶标抗体等，因此无需对每一抗体进行标记

50、双抗体夹心法Double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA是一种直接法。首先用病毒特异性抗体IgG包被微板孔，然后参加待检样品粗提液，使包被的抗体捕捉样品中的病毒粒子，再参加酶标抗体，最后参加底物，室温避光放置一定时间后，判断结果A蛋白酶联免疫吸附法Protein A sandwich ELISA，PAS-ELISA 为一种间接法。首先用A蛋白包被微板的孔，然后参加病毒的抗体，再参加待检样品粗提液，经第二层抗体与病毒结合，参加酶标记A蛋白，最后参加底物，室温避光放置一定时间后，判断结果。 电泳分析 在类病毒的检测中应用广泛 ，类病毒为环状单链RNA分子 ，大小

51、为246375个核苷酸nt，内部碱基高度互补。在自然情况下形成棒状或三叶草状的二级结构，在常规电泳条件下迁移较快；在变性条件下，由于二级结构破坏而成环状，在电泳介质中迁移减缓，而与其它小分子物质分开，表现类病毒的特有电泳条带。因此双向电泳也是鉴别一种病原是否为类病毒的常用技术。 PCR技术 病毒和类病毒的基因组成已经明确，可以根据序列设计特异引物进行PCR检测 核酸杂交技术 探针四、脱毒技术在园艺植物上的应用1茎尖培养脱毒2热处理结合茎尖培养脱毒3病毒检测1热处理工艺脱毒法2热处理结合茎尖培养脱毒3茎尖微芽嫁接1热处理结合茎尖培养脱毒2脱毒苗培育三, virus-free identifica

52、tion(a) detoxification effect of detection1. The test form2. The indicator plant method(1) herbs: SAP friction law, a certain organization, is taken from the inspected plants including leaves, petals, root, or skin, add 2 5 times (V/W) extraction buffer, under the condition of low temperature grindi

53、ng, and then dipped in SAP on the selected indicator plant leaves with emery gently friction, immediately after inoculation with distilled water rinse clean leaf juice. Then put the indicator plant in 22 to 28 , half shade under the condition of growth, the symptoms of regular observation and record

54、 indicator plant reaction.(2) the woody plants: friction SAP inoculation; Grafting vaccinal3. The serological detectionAntigen (antigen) : every injected into the animals animals can stimulate the bodys immune response of the substances are known as antigens.Antigen, stimulate the animals immune res

55、ponse and antibody production features of immunogenicity; antigen can combine with produced antibody specificity, this feature is called reaction was; antigenicity of the above two es., both of the two features antigen material called complete antigen; Only the original sex reaction, no immunogenici

56、ty of antigen material called haptens.Plant virus antiserum preparation(1) the separation and purification of virus antigen and preparationFrom the infected host plants, through physical and chemical methods, separate the virus and host plants of various components, in order to obtain pure virus pro

57、ducts. virus antigen preparation methods, the main steps include fractional precipitation, differential centrifugation and gradient centrifugation, concentrated virus.Plant virus antibody preparation(1) plant virus antiserum preparation of purified virus antigen immunization animal. Commonly used an

58、imals for rabbit, choose and a half years old or so commonly, 2 - 3 kg weight, healthy, natural antibody negative Japanese big ear rabbit rabbit and half an ear lobe. The above method of preparation of antiserum contain a variety of antibodies, these antibodies are produced by animal variety of lymp

59、hocytes, so also known as Polyclonal antibody (Polyclonal antibody, Pab)(2) monoclonal antibody Monoclonal asexual cell line (Monoclone) is a single, or single cell lineage. Monoclonal antibody is produced by immune single-celled animals department of antibodies.Commonly used serological detection m

60、ethod(1) the immune electron microscopy technology (Immunoelectron microscopy, IEM) is the specialization of antigen and antibody immune response combined with electron microscope a virus detection method. Its easy operation, intuitive results.The antigen adsorption - immune modifier - dyeing - tem