冷冻干燥的细胞学基础

1、For personal use only in study and research; not for commercial use第三章冷冻干燥的细胞学基础用冻干法保存菌种、菌苗、病毒等活的微生物的基本原理是将微生物（或其 宿主）及其载体中的水分先冻结成冰晶，然后在真空低温下升华，除去其中95% 甚至99. 5%的水分，使其新陈代谢等生命活动基本停止，处于休眠状态，储存 中不改变原来的性状。由于微生物，特别是单细胞微生物的体积小，结构简单，生物学特性比较接 近，其细胞功能和生命活动在一个细胞内可完全体现，且对环境的适应性强，冻 干中某些非致死性的生理损伤，可以在短期内修复，又易于分散于悬浮

2、液中，因 此，用冻干法保存微生物被认为是现今最优良最方便的方法之一。然而，评估这些材料冻干保存的主要指标是细菌的存活性和其特性的稳定 性。如果冻干造成细胞活性极差或其基本特性被丢失的话，则这种细胞就无任何 储存的价值。至于鱼、肉、果蔬等食品的冻干保存，虽然不以存活为目的，但冻 干中若其细胞结构遭到破坏，复水后细胞内汁液大量流失，产品失去了复原性和 原有的口感风味，这也不是我们所希望的。因此，如何提高冻干后细胞的存活率 和结构的完整性，保持活细胞特性的稳定性，乃是冻干机理研究的又一重要课题。冻干对细胞造成损害是肯定的。迄今为止还没有一种微生物细胞冻干后 100%存活的先例。许多产品在冻干储存后复

3、水初期，需要一个修复过程，才能 与正常细胞一样同步生长。这些都说明冻干对微生物细胞造成了损伤，只是损伤 程度不同而已。较轻的造成生理性损伤，经修复还可复原。严重的则造成细胞生 命的死亡。本章的任务，就是介绍目前关于冻干对细胞造成损伤的一些看法。探 讨如何优化冻干条件和添加合适的保护剂，以减轻细胞损伤和死亡。第一节细胞冻结的损伤机理冻结对生物体细胞的损伤机理，虽然有过多方面的研究，也发表了为数众多 的理论和假说，但由于生物种类的多样性和冻结过程中细胞内物理变化、化学变 化、生物变化的复杂性，使得迄今尚无统一的看法。在众多的理论假说中，有细 胞膜溶质损伤说、机械损伤说、两因素假说、结构水说、细胞器

4、损伤说、最小体 积说、温度休克说和细胞缺氧说等。这里仅简单介绍前面四种假说。一、细胞膜溶质损伤说Lovelock认为细胞的损伤是因为冻结使细胞脱水，电解质浓度增加， 细胞长时间置于高浓度溶液中，造成细胞膜类脂蛋白复合体的破坏和膜的分 解。Levitt认为，特殊的胞内溶质（结构蛋白）的浓缩，使蛋白质分子彼此靠 近，有利于二硫键将蛋白质分子彼此连接起来，而不能恢复到原天然结构。 这种不可逆变化，造成细胞功能的丧失和细胞死亡。Williams认为，冷冻使渗透压增加，造成细胞收缩，使细胞膜内表面 压力增加。细胞膜的收缩可引起一系列的变化，包括膜相分离、膜的萎缩、 膜成分的丧失等。总之，这些理论都认为，

5、由于细胞膜内溶质脱水浓缩，从而造成细胞 膜的分解和变性。二、机械损伤说这种假说认为，冰晶在细胞内形成，由于其体积比原来 的增大9% lo%，在细胞内、外形成冰晶的瞬间，挤压细胞膜的薄弱部分.使之破裂，或冰晶在细胞内生长时晶尖穿破膜壁导致细胞死亡。Mackenzie和Bank认为，胞内冰形成并不一定会对细胞产生致命的损 伤，但在复温中，胞内冰发生再结晶，由于冰晶的生长，或在形状、方位上发 生改变，均会刺破或挤压细胞膜，造成细胞的损伤。三、两因素假说1972年，Mazur将1949年以来人们经过20多年的探索得到不同类型细胞 的冷冻速率和细胞存活率的关系整理成曲线，说明每种细胞有一个最佳的冷却 速

6、率，如图31所示。由此，他认为造成冷冻损伤有两个独立的因素，一是过 快的冷却形成胞内冰，造成膜的机械损伤，且冷却速率越快损伤也越大；二是 慢速冷却时，胞外结冰而胞内尚未结冰，胞内的水分子会在水蒸气分压差推动 下，渗透到胞外冻结，造成胞内外溶质浓缩，而产生溶质损伤，且冷却速率越 慢，其损害也越大。综合上述两种因素的影响，得出如图32所示的总的效果 曲线。如图3-2所示，对于某一种细胞，存在着某个最佳的冷却速率，对应有 最大的存活率，过快或过慢的冷却速率，都会导致细胞的损伤增大，降低存活 率。四、结构水说结构水说认为，细胞冷冻致死的首要原因，是冷冻促使从细胞膜、蛋白质 等结构中除去极其重要的结构水，使细胞失去功能而死 亡。仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur fur den personlichen fur Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l etude et la recherche uniquement a des fins personnelles; pas a des fins commerciales.to 门 b ko g门只